基因SNP檢測技術(shù)比較1PPT課件基因多態(tài)性檢測技術(shù)：一DNA測序技術(shù)（DNAsequence）二基因芯片（genemicroarray）技術(shù)三實時定量PCR（RealtimePCR，RT-PCR）技術(shù)2PPT課件一DNA測序技術(shù)

從1977年第一代DNA測序技術(shù)（Sanger法），發(fā)展至今三十多年時間，測序技術(shù)已取得了相當大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代，測序讀長從長到短，再從短到長。下面我們就一一介紹前三代測序技術(shù)。3PPT課件第一代測序技術(shù)Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)。4PPT課件第二代測序技術(shù)

第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達1000bp，但其測序成本高，通量低嚴重影響了真正大規(guī)模的應(yīng)用。而經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標記的第二代測序技術(shù)誕生了。5PPT課件1.Illumina(1)DNA待測文庫

構(gòu)建(2)Flowcell(3)橋式PCR擴增

與變性(4)測序6PPT課件7PPT課件2.Roche454(1)DNA文庫制備(2)EmulsionPCR(3)焦磷酸測序8PPT課件9PPT課件第三代測序技術(shù)以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)。10PPT課件PacBioSMRT技術(shù)基本原理：DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標記4種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。11PPT課件OxfordNanoporeTechnologies當DNA堿基通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度，靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。12PPT課件二基因芯片技術(shù)基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。13PPT課件九、基因芯片檢測原理及簡要過程14PPT課件三實時定量PCR技術(shù)

由于染料不能區(qū)分特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體等非特異產(chǎn)物，也不能區(qū)分不同探針，所以檢測的特異性始終不如后來出現(xiàn)的探針法；也不能做多重PCR檢測（Multiplex）。15PPT課件TaqMan技術(shù)FwdRevSpecificTargetAmplification(ifnecessary)

YAllele-SpecificGenotypingReactionTaqManProbesFwdRev

Y

TCTaqMan技術(shù)

T

YC1.Probehybridization2.Targetamplification

Y

T

T

Y3.Probedisplacement&cleavage4.PCR&cleavageproductsMGB技術(shù)原理：針對Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，3'端采用了非熒光性的淬滅基因，大大降低了本底信號的干擾。此外，MGB探針的3'端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交,而短探針的熒光報告基團和淬滅基團的距離更近,淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高：一個15bp的MGB探針的信噪比大于6,優(yōu)于理想狀態(tài)下的25bp的普通Taqman探針（信噪比約為1.5）。允許采用更短的探針也簡化了探針的設(shè)計和成本。18PPT課件FRET技術(shù)

原理：探針由兩條和模版互補、且相鄰的特異探針組成（距離1—5bp），上游探針的3`端標記供體熒光基團，相鄰下游探針的5`端標記Red640受體熒光基團。當復(fù)性時，兩探針同時結(jié)合在模板上，供體基團和受體基團緊密相鄰，激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被Red640基團吸收，使得檢測探頭可以檢測到Red640發(fā)出波長為640的熒光。當變性時，兩探針游離，兩基團距離遠，不能檢測到640波長的熒光。FRET探針檢測的信號是退火時的實時信號，每次檢測信號始終嚴格對應(yīng)模版的數(shù)量，非累積信號，可以用于做Tm曲線和SNP檢測。兩個單標記探針的長短不影響信號的傳遞，而探針間的距離通常為1-5bp。19PPT課件分子信標技術(shù)分子信標（Molecularbeacon，MB）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記