分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)閆小毅電話:88208257E-Mail:人類外周血染色體標(biāo)本制備G帶觀察及核型分析人類外周血染色體標(biāo)本制備染色體G帶觀察染色體核型分析人類外周血染色體標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜と祟愅庵苎馨图?xì)胞的培養(yǎng)方法。初步掌握人類染色體標(biāo)本培養(yǎng)和制備的基本方法實(shí)驗(yàn)原理在細(xì)胞周期的不同階段,染色體的結(jié)構(gòu)不同,在細(xì)胞分裂間期,染色體呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的絲狀結(jié)構(gòu),分散于細(xì)胞核中,且交織成網(wǎng)狀,難以識(shí)別其數(shù)目和每個(gè)染色體特有的結(jié)構(gòu);在細(xì)胞有絲分裂中期,染色體凝縮形成短的棒狀結(jié)構(gòu),排列在赤道板上,此時(shí)染色體的形態(tài)、數(shù)目最清楚,所以一般選擇有絲分裂中期的細(xì)胞來觀察染色體的形態(tài)、數(shù)目。在人類遺傳分析中,普遍采用外周血培養(yǎng)的方法制備染色體標(biāo)本。但是在正常情況下,外周血中的淋巴細(xì)胞,幾乎都處在G1期或G0期,因而外周血細(xì)胞中是沒有分裂相的。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA),可以刺激外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞,進(jìn)行有絲分裂,再通過秋水仙素處理,將細(xì)胞阻斷在有絲分離中期。再通過離心、低滲、固定和滴片,就可以獲得大量有絲分裂相。最后通過染色就可以觀察染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目。本方法已為臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、遺傳毒理學(xué)等方面廣泛應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)步驟采血2、培養(yǎng)RPMI1640培養(yǎng)液,37℃±0.5℃恒溫中培養(yǎng)72小時(shí)。3、秋水仙素(colchicine)處理在終止培養(yǎng)前2-3小時(shí),加入秋水仙素4、離心以1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,棄上清,留沉淀并用吸管打勻5、低滲處理加⑧毫升預(yù)溫(37℃)的0.075MKC低滲液(hypotonicsolution),用吸管打勻使細(xì)胞懸浮于低滲液中,37℃水浴箱靜止25-30分鐘。6、預(yù)固定低滲后,加新配的固定劑(甲醇:冰醋酸,3:1)1毫升,打7、離心8、固定pm離心10分鐘,棄上清以1000加入5m新配置的固定液,懸浮細(xì)胞,室溫固定10-15分鐘9、離心1000pm離心10分鐘,棄上清10、再固定,加入5mL固定液(甲醇:冰醋酸=1:3),室溫固定10-15分鐘、再離心1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,棄去上清液。12、再固定加入固定液(甲醇:冰醋酸1:1)5mL,打勻,固定10-15分鐘。13、制片固定后,1000轉(zhuǎn)專分離心留下0.2m沉淀物,吸取細(xì)胞懸液滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上,立即用嘴吹散,在灑精燈焰上通過幾次,使細(xì)胞平鋪于載玻片上,空氣干燥(airdrying)。14、染色(Giemsastaining)Giemsa染液染色8分鐘,玻片用自來水沖洗,晾干。15、鏡檢(microscopICeXamination)_m,CelsedimentCContriJarforstainiAnalysis}antorakaryotypeKaryotyp曰Metaphaseunderthemicroscope四、試劑和藥品1、培養(yǎng)液的配制RPMI1640培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉)80%小牛血清(56℃水浴滅活30分鐘)20%植物血凝素PHA(主要成分是粘多糖和蛋白質(zhì)4%青霉素終濃度100單位/毫升鏈霉素終濃度100單位/毫升用3.5%Nahco調(diào)pH到7.