凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)第1頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月凱氏定氮法

測定食品中蛋白質(zhì)

第2頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概述

蛋白質(zhì)是以氨基酸為最小構(gòu)成單元的大分子的含氮化合物，它是由20種氨基酸通過酰氨鍵以一定方式結(jié)合，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)。第3頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月1生命的物質(zhì)基礎(chǔ)3遺傳信息的表達(dá)方式5人及動(dòng)物需要從食品得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物，來構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)2維持酸堿平衡、水平衡4維持物質(zhì)的代謝及運(yùn)轉(zhuǎn)6營養(yǎng)指標(biāo)、食品生產(chǎn)工藝指標(biāo)。生理功能及在食品中的作用第4頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月常見食物中蛋白質(zhì)的含量牛肉螺旋藻第5頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月常見食物氮系數(shù)氮系數(shù)：蛋白質(zhì)含氮量的倒數(shù)，常用6.25表示。第6頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)測定方法方法時(shí)間應(yīng)用范圍優(yōu)缺點(diǎn)凱氏定氮法8-10h0.2-1.0mg氮時(shí)間長雙縮脲法20-30min1-10mg氮靈敏度低、快速檢測Folin－酚試劑法40-60min<5mg氮靈敏度高、耗時(shí)長、試劑配制困難紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)法5-10min5-15min50-100mg蛋白質(zhì)0～0.1mg/mL層析柱流出物檢測較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微非線性第7頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月二、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)（粗蛋白）

凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量。1.原理1樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出2樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨3加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定第8頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月消化蒸餾吸收、滴定計(jì)算2.實(shí)驗(yàn)步驟第9頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月第一步：樣品消化

樣品與濃硫酸加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水并破壞有機(jī)物，C、H氧化為二氧化碳、水逸出，蛋白質(zhì)分解為氨、與硫酸結(jié)合生成硫酸銨、留在溶液中

對(duì)原子的前處理，使被測物質(zhì)進(jìn)入溶液中，使不溶變?yōu)榭扇?、有機(jī)物分解為可溶性無機(jī)物消化第10頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）消化總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）第11頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月消化裝置“自動(dòng)回流消化儀”第12頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月定氮消化的不同狀態(tài)RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+(NH4）2SO4澄清消泡碳化第13頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月消化過程中試劑作用硫酸鉀：提高溶液沸點(diǎn)、加快反應(yīng)進(jìn)程；硫酸銅（藍(lán)綠色）：催化作用褐色第14頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O第二步——蒸餾第15頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月01氫氧化鈉需過量、若不夠，會(huì)生成H2S,H2S是強(qiáng)酸，會(huì)使溶液顏色變紅02防止樣液中氨氣逸出。注意事項(xiàng)：第16頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月(3）吸收與滴定吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，

硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用

硫酸、鹽酸溶液也可用作吸收劑。第17頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月各步驟操作細(xì)節(jié)圖解：

樣品消化→蒸餾→滴定（1）樣品消化樣品+0.4g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數(shù)粒先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍(lán)綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘45度角消化終點(diǎn)瓶口不能對(duì)著人蓋上小漏斗第18頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）蒸餾將消化液全部轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示劑2～3d加入NaOH溶液后顏色為深藍(lán)色或褐色通入蒸汽開始蒸餾冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反應(yīng)室，立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。第19頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月吸收液變藍(lán)色后繼續(xù)蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接收瓶，關(guān)閉電源第20頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）滴定取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。滴定前滴定終點(diǎn)同時(shí)做一試劑空白實(shí)驗(yàn)，記錄空白滴定消耗鹽酸的體積。第21頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)—消化（1）不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶、緩和沸騰消化（2）消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘，一般消化時(shí)間約4小時(shí)（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡劑（4）樣品不易澄清時(shí)可冷卻后加入30%過氧化氫2-3ml第22頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月小結(jié)第23頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月自動(dòng)凱氏定氮儀法在凱氏定氮法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的自動(dòng)凱氏定氮儀法，具有安全、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。儀器：消化爐自動(dòng)蒸餾裝置第25頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、原理及適用范圍2、特點(diǎn)：

（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。第26頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月雙縮脲法（分光光度法）1.原理——雙縮脲反應(yīng)

堿性條件下、雙縮脲與硫酸銅作用生成紫紅色配合物的反應(yīng)。

肽鍵（-CO-NH-）與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似、能呈現(xiàn)此反應(yīng)。

560nm處、由顏色深淺判定蛋白質(zhì)