專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用知識點(diǎn)2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng).培養(yǎng)基是人們按照微生物對巨竺㈣的不同需求，配制出供其區(qū)技繁型的營養(yǎng)基質(zhì),是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。.培養(yǎng)基按物理性質(zhì)分為型培養(yǎng)基（應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)）、唧何培養(yǎng)基（應(yīng)用于微生物的分離和鑒定）和呼冏培養(yǎng)基（常用于觀察微生物的運(yùn)動及菌種保藏等）。按成分分為四培養(yǎng)基（用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，成分種類比例明確，用于微生物的分離鑒定）和Kg培養(yǎng)基（用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)）。按用途分為由培養(yǎng)基（加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要微生物生長，促進(jìn)所需微生物的生長）和型培養(yǎng)基（根據(jù)微生物的特點(diǎn)，加入某種指示劑或化學(xué)藥品，來鑒別不同類別的微生物）。.培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括：I水、無機(jī)鹽、碳源、氮源和生長因子I等。碳源包括CO「NaHeO3等到碳源和糖類、石油、花生粉餅等獨(dú)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用冏機(jī)隧源。單質(zhì)碳不能作為碳源。氮源包括N、NH、NO-,NH+等砂氮源和蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白陳3 3 4 |___等侑叫氮源。只有回氮微生物才能利用N。.培養(yǎng)基還需滿足|pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣I的要求。例：培養(yǎng)乳酸桿菌需添加維生素；培養(yǎng)霉菌需將PH調(diào)至酸性；培養(yǎng)細(xì)菌需將PH調(diào)至中性或微堿性；培養(yǎng)厭氧型微生物需提供無氧的條件。.無菌操作技術(shù)包括：①對實(shí)驗(yàn)操作的型、操作者的樂著和書,進(jìn)行清潔和消毒。②將用于微生物培養(yǎng)的I器皿、接種用具和培養(yǎng)苗等器具進(jìn)行滅菌。③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在愷”燈火焰附近世行。⑷實(shí)驗(yàn)操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具吧圍的物品,目接觸。.消毒與滅菌的區(qū)別是：消毒指使用較為圈租的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括睜硒町）,包括博沸幟毒法,Eq消毒法（酒精、氯氣、石炭酸）和黑產(chǎn)消毒法。滅菌指使用網(wǎng)的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生肉，包括閉抱和抱子「包括!灼燒I滅菌、I十熱IX菌、網(wǎng)壓蒸汽I滅菌。.滅菌方法：①I接種環(huán)、接種針、試管川等使用灼燒滅菌法;②畫器迎、金屬用具I等使用干熱滅菌法,所用器械是干熱滅菌箱；③可基、無洋水隹使用高壓蒸汽滅菌法,所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；@表面火幽和空氣滅闞等使用紫外線滅菌法,所用器械是紫外燈。.制作牛肉膏蛋白陳固體培養(yǎng)基（1）方法步驟：計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。（2）倒平板操作的步驟包括：①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在J酒精燈滅網(wǎng)旁的桌面上，叵可拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，回拔出棉塞。②將錐形瓶的瓶口科速通過滅呵（灼燒滅菌,防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基）。③將培養(yǎng)皿打開一條箱大于瓶口的縫隙,再將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約S巴IIL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。⑷等待平板冷卻凝固然后，將平板即來慳置,使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上（目的：使g基表面的水分I更好地?fù)]發(fā),又可以防止皿蓋上的水珠沁培養(yǎng)基，造I成污染.倒平板時若不慎將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底上，則這個平板不能用來培養(yǎng)微生物，原因是聲氣中的微生物會在迎蓋與瓜底上生埒.純化大腸桿菌的原理是：用世板劃線I法和他釋涂布平板陵接種,使聚集在一起的微生物I分散成單個細(xì)鳴,從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落（生態(tài)學(xué)上稱西）,以達(dá)純化菌種的目的。∏?平板劃線操作時第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)的原因是：前者避免即環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)叫,后者殺死Eg劃線殘留在環(huán)上的菌種卜使菌種逐漸變少以便得到單個菌落。在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)的原因是及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌可環(huán)境和感染操作者卜在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后再進(jìn)行劃線的原因是避免隹種環(huán)溫度太高而殺夕匕菌種Io.涂布平板操作的步驟包括：①將涂布器浸在盛有四的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。③將沾有少量酒精的涂布器在件焰上引燃卜待酒精燃盡后，冷卻8?IOso⑷用I涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。.菌種的保存：頻繁使用，臨時保存接種到I固體斜面培養(yǎng)基,在4。C下保存。長期保存菌種用I甘油管藏I的方法。2.2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù).尿素是重要的農(nóng)業(yè)圖巴，不能直接被植物吸收。土壤中有一類細(xì)菌能合成慳呵.將尿素分解成同，被植物吸收利用。尿素最初是從人的尿網(wǎng)中發(fā)現(xiàn)的。.實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理是：人為提供有利于［目的曲颯生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、PH等），同岬卬制或阻止蘆他微生物生長。.在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作叩培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)基中不加I I入內(nèi)機(jī)物FJ以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物;培養(yǎng)基中不加入網(wǎng)元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物；加入I高濃度的食闞可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。.測定微生物數(shù)量的常用方法法稀釋涂布平板板和I顯微鏡直接計(jì)數(shù)。.稀釋涂布平板法常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。原理是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌卜統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇F研個菌落數(shù)在［30?300I的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取甲均制。.統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目阿原因是當(dāng)嚴(yán)或多個細(xì)胞連在一起眇,平板上看到的只是一個菌落，因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。.設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中I非測試因抨寸實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對照實(shí)驗(yàn)是指除了I被測試的I條件以外,其他條件即相同的實(shí)驗(yàn),其作用是比照試驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是區(qū)測試的條件I引起相應(yīng)的結(jié)果。.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括I實(shí)驗(yàn)方案卜所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實(shí)施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。.土壤取樣：鏟去表層土，在距地表約Qcm的土壤層從富含邛雨、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。10.I樣品的稀釋程可將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實(shí)際操作中，通常選用一定稀釋范圍（闞闞一般選用ICK106；睥線畫一般選用103、104、105；畫一般選用102、103?104）的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在M300I之間、適于計(jì)數(shù)的平板?！?不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細(xì)菌30-37℃1-2天；放線菌25-28℃5-7天；霉菌25-28℃3-4天。12.每隔24小時統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止悝培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目卜一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、唯獨(dú)及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的眄落特叫（形狀、大小、隆起程度和顏色基本一致）13.每克樣品中的菌落數(shù)二|（C∕V）>C可（C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml）；M：代表稀釋倍數(shù)）14.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入網(wǎng)紅指示利,培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH叫，指示劑變紅，可初步鑒定該種細(xì)菌能分解尿素為網(wǎng)。2.3分解纖維素的微生物的分離.纖維素是一種由畫獨(dú)首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的巴為物質(zhì)。叫是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物,木材、作物桔川等也富含纖維素。.纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即En1 IC酶和葡萄糖苜酮,前兩種酶使纖維素分解成甲≡n?第三種酶將X 纖維二糖分解成陶萄啊,為微生物的生長提供營養(yǎng)。.當(dāng)在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入些巴時，它能與培養(yǎng)基中的纖維素形成I紅色復(fù)合叫。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，I剛果紅一纖維素］的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以I纖維素分解闞為中心的透明圈,根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈就可以來篩㈣纖維素分解啊,這種方法叫做網(wǎng)果紅染色法。.剛果紅染色法I篩選纖維素分解網(wǎng)的原理:剛果紅（染料）可以與像婁㈣這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和內(nèi)解后的纖維二糖和葡萄糖I發(fā)生這種反應(yīng)。.實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣f選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定）f網(wǎng)因稀釋f將樣品涂布到修別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上f挑選產(chǎn)生透明圈I的菌落.為確定得到的是纖維素分解菌，需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶I的實(shí)驗(yàn)。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測定。.由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。.將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。.剛果紅染色法種類：一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)；另一種是在倒平板時就加入剛果紅。前者的缺點(diǎn)是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點(diǎn)是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有回類