第七章發(fā)酵生產(chǎn)的染菌及防治第1頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月緒論 發(fā)酵染菌指在發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它微生物浸入發(fā)酵系統(tǒng)生長繁殖，影響了純種培養(yǎng)過程。據(jù)報(bào)道內(nèi)青霉素發(fā)酵染菌率為2%，鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素發(fā)酵的染菌率為5%，谷氨酸發(fā)酵噬菌體感染率為1%~2%。染菌對(duì)發(fā)酵過程有重大的影響，進(jìn)而影響到發(fā)酵產(chǎn)率、提取率、得率、產(chǎn)品質(zhì)量、三廢處理等。 在現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)條件下要做到完全不染菌是不可能。目前要做的是要提高生產(chǎn)技術(shù)水平，強(qiáng)化生產(chǎn)過程管理，防止發(fā)酵染菌的發(fā)生。如發(fā)生染菌，應(yīng)盡快找出污染的原因，并采取相應(yīng)的有效措施，把發(fā)酵染菌造成的損失降低到最小。第2頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月1、染菌對(duì)發(fā)酵的影響種子染菌發(fā)酵染菌(發(fā)酵前、中、后）2、染菌檢查判斷鏡檢肉湯培養(yǎng)平板/斜面培養(yǎng)第3頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月3、染菌原因分析

菌體生長緩慢

種子培養(yǎng)異常菌絲結(jié)團(tuán)泡沫多異?，F(xiàn)象代謝不正常

發(fā)酵異常菌體生長差

PH過高或過低溶解氧異常菌濃過高或過低第4頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月4、常見染菌類型青霉素細(xì)短產(chǎn)氣桿菌、粗大產(chǎn)氣桿菌鏈霉素細(xì)短桿菌、假單孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、粗大產(chǎn)氣桿菌四環(huán)素雙球菌、芽孢桿菌、夾膜桿菌檸檬酸

青霉菌谷氨酸噬菌體酒類發(fā)酵醋酸菌、乳酸菌規(guī)模：大量罐染菌，個(gè)別連續(xù)染菌、部分罐染菌第5頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌室沙土管，試管種子帶菌培養(yǎng)基空氣帶菌污染途徑操作失誤設(shè)備噬菌體種子培養(yǎng)期：滅菌或棄之染菌挽救發(fā)酵前期：滅菌后補(bǔ)加種子或分罐中、后期：加殺菌劑或抗生素、通風(fēng)攪拌設(shè)備用120℃30min殺菌第6頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月6、污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響 生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物。不同污染時(shí)間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果。第7頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月6.1、噬菌體的污染與防止感染途徑：

三個(gè)必要條件

環(huán)境帶菌、環(huán)境帶活菌、噬菌體與活菌接觸防止措施：（1）、以環(huán)境凈化為中心（2）、以“種”為中心（3）、以空氣凈化系統(tǒng)為中心（4）、以設(shè)備、管道為中心（5）、以管理為中心、輪換使用菌種Phage的主要生物學(xué)特征:（1）具有專一的寄主性，在菌體繁殖的情況下繁殖（2）不耐熱性，700C以上其基本失（3）pH穩(wěn)定性pH大于10，pH小于5Phage急劇失活（4）不耐藥性（5）對(duì)干燥的穩(wěn)定性第8頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月6.2污染其它雜菌

有些雜菌會(huì)使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。

有的雜菌會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會(huì)反復(fù)染菌。

第10頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月

大罐染菌的挽救1、發(fā)酵前期；滅噬、易種法、用抗性菌2、發(fā)酵中期：易種、并罐3、發(fā)酵后期：實(shí)消放罐噬菌體的檢測1、單層噬菌斑法2、雙層噬菌斑3、平板交叉劃線法4、快速檢查法5、液體培養(yǎng)檢查法事前分別配制2%和1%瓊脂的兩種培養(yǎng)基，將2%的培養(yǎng)機(jī)作底層，鋪成平板待用，用生理鹽水洗下生長旺盛的細(xì)菌斜面，配制菌懸液。取此0.2ml和被測定的Phage液or待檢樣品液0.1ml于試管中，加入冷卻至450C的含1%的瓊脂培養(yǎng)基3~4ml混勻后立即倒在2%的培養(yǎng)基平板上，保溫培養(yǎng)16~20hr，如有Phage，在上層出現(xiàn)透明無菌的圓形or近圓形空斑。將Phage和菌懸液與含有0.5~0.8%瓊脂的培養(yǎng)基混合，在無菌載波片上凝固，經(jīng)過培養(yǎng)后在鏡檢計(jì)數(shù)。用500ml三角瓶加50ml一級(jí)種子培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后，接入0.5~1ml需檢查之發(fā)酵液或種子液，置于搖床上培養(yǎng)10~12hr,觀察液體渾濁度。若渾濁度OD正常，鏡檢無染菌，正常。若液體清，說明感染。第11頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月一、染菌對(duì)不同發(fā)酵過程的影響

由于各種發(fā)酵過程所用的微生物菌種、培養(yǎng)基以及發(fā)酵的條件、產(chǎn)物的性質(zhì)不同，染菌造成的危害程度也不同。如：青霉素的發(fā)酵過程核苷或核苷酸的發(fā)酵過程檸檬酸等有機(jī)酸的發(fā)酵過程谷氨酸的發(fā)酵過程

第一節(jié)染菌對(duì)發(fā)酵的影響 染菌對(duì)發(fā)酵過程的影響很大，但由于生產(chǎn)的產(chǎn)品不同、污染雜菌的種類和性質(zhì)不同、染菌發(fā)生的時(shí)間不同以及染菌的途徑和程度不同，染菌造成的危害及后果不同。T4噬菌體細(xì)菌第12頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月一、染菌對(duì)不同發(fā)酵過程的影響（續(xù)）：

放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細(xì)菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。（1）抗生素：青霉素生產(chǎn)中污染產(chǎn)青霉素酶的雜菌（自身產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生），在發(fā)酵過程中，都會(huì)使青霉素迅速分解破壞，使目的產(chǎn)物得率降低，危害十分嚴(yán)重。一般污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大。鏈霉素（污染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大）、四環(huán)素（污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大）、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會(huì)造成不同程度的危害?；尹S霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對(duì)細(xì)菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。

第13頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）核苷或核苷酸發(fā)酵過程：因生產(chǎn)菌多為營養(yǎng)缺陷型微生物，其生長能力差，所需的培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，易受到雜菌的污染，且染菌后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制了生產(chǎn)菌的生長和代謝產(chǎn)物的生成，污染芽孢桿菌的危害最大。

（3）檸檬酸等有機(jī)酸發(fā)酵過程：一般在產(chǎn)酸后發(fā)酵液的pH值比較低，雜菌生長十分困難，在發(fā)酵中、后期不太會(huì)發(fā)生染菌，主要是要預(yù)防發(fā)酵前期染菌，最怕污染青霉菌。（4）谷氨酸發(fā)酵：周期短，生產(chǎn)菌繁殖快，培養(yǎng)基不太豐富，一般較少污染雜菌，但噬菌體污染對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響較大。（5）疫苗：多采用深層培養(yǎng)，是不經(jīng)提純直接使用的產(chǎn)品，在其培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。第14頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月三、染菌發(fā)生的不同時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響污染時(shí)間：是指用無菌檢測方法能檢測到的污染時(shí)間（因?yàn)殡s菌進(jìn)入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長、繁殖的時(shí)間才能顯現(xiàn)出來），不是雜菌浸入發(fā)酵系統(tǒng)的時(shí)間。顯現(xiàn)的時(shí)間又與污染菌量有關(guān)。3.1、種子培養(yǎng)期染菌種子培養(yǎng)期（主要是細(xì)胞生長繁殖期）：微生物菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)十分豐富、培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產(chǎn)物）或只有很少抗生素（產(chǎn)物），故比較容易染菌，。措施：一旦發(fā)現(xiàn)種子受到雜菌的污染，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄去，并對(duì)種子罐、管道等進(jìn)行仔細(xì)檢查和徹底滅菌。第15頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2、發(fā)酵前期染菌

雜菌與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分，干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的形成，發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。措施：可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營養(yǎng)，重新接種再用。第16頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3、發(fā)酵中期染菌

嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的生成。較嚴(yán)重影響發(fā)酵液理化性質(zhì)，如雜菌大量產(chǎn)酸，pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時(shí)甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時(shí)也會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。第17頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月3.4、發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對(duì)雜菌有一定的抑制或殺滅能力。如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。如污染嚴(yán)重，可采取措施提前放罐第18頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月四、不同染菌途徑對(duì)發(fā)酵的影響種子帶菌：種子帶菌可使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性空氣帶菌：空氣帶菌也使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性，導(dǎo)致染菌范圍擴(kuò)大至所有發(fā)酵罐培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續(xù)性設(shè)備滲漏：這種途徑造成染菌的危害性較大第19頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月五、染菌對(duì)產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響（1）對(duì)過濾的影響發(fā)酵液的粘度加大（菌體自溶、發(fā)酵不徹底）。造成過濾時(shí)間拉長，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞生產(chǎn)平衡；大幅度降低過濾收率。（2）對(duì)提取的影響溶媒萃取：易發(fā)生乳化離子交換：預(yù)處理分離不徹底的膠體物質(zhì)（水溶性蛋白質(zhì)等）易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量，洗脫時(shí)易混入產(chǎn)品中。第20頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響因含有較多分離不徹底的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品的純度有較大影響，同時(shí)會(huì)使產(chǎn)品放置一段時(shí)間后增大出現(xiàn)混濁的可能，影響產(chǎn)品的外觀。六、染菌對(duì)三廢處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用，發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費(fèi)用和時(shí)間。第21頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)發(fā)酵異常現(xiàn)象及原因分析一、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異常現(xiàn)象發(fā)酵過程中的種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象是指發(fā)酵過程中某些物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)或生物參數(shù)發(fā)生與原有規(guī)律不同的改變，這些改變必然影響發(fā)酵水平，使生產(chǎn)蒙受損失。1、種子培養(yǎng)異常（表現(xiàn)為培養(yǎng)的種子質(zhì)量不合格）：菌體生長緩慢；菌絲結(jié)團(tuán)；代謝不正常。2、發(fā)酵異常：菌體生長差；pH值過高或過低；溶解氧水平異常；泡沫過多；菌體濃度過高或過低；菌體生長差。第22頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月谷氨酸發(fā)酵時(shí)正常和異常的溶氧曲線噬菌體第23頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月二、染菌的檢查和判斷1、檢查的目的、意義以無菌試驗(yàn)的結(jié)果較可靠、迅速的判斷染菌，以及時(shí)采取處理措施。每個(gè)工序或經(jīng)一定時(shí)間都應(yīng)進(jìn)行取樣檢查。無菌試驗(yàn)的目的：（1）監(jiān)測培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及附屬設(shè)備滅菌是否徹底（2）監(jiān)測發(fā)酵過程中是否有雜菌從外界侵入，生產(chǎn)過程中是否存在染菌的隱患和死角2、生產(chǎn)上常用的檢查方法有：①顯微鏡檢查（簡便、快速，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)雜菌，但鏡撿取樣少，觀察面也小，則不易撿出早期雜菌）；②平板劃線檢查；③肉湯培養(yǎng)檢查。（后兩種操作較繁瑣（需過夜培養(yǎng)），但能撿出比前者更少的雜菌，結(jié)果為主要依據(jù)）第24頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月表8-1發(fā)酵過程的雜菌檢查

除了上述方法外，還對(duì)參數(shù)的變化情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以參數(shù)的異常變化來判斷是否染菌。第25頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月3、發(fā)酵染菌率計(jì)算基準(zhǔn)總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。染菌批次數(shù)應(yīng)包括染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再次染菌的批次數(shù)在內(nèi)。是我國的統(tǒng)一的習(xí)慣計(jì)算方法總?cè)揪?=還用設(shè)備染菌率（統(tǒng)計(jì)發(fā)酵罐或其他設(shè)備的染菌率）、不同品種發(fā)酵的染菌率、不同發(fā)酵階段的染菌率、季節(jié)染菌率、操作染菌率等統(tǒng)計(jì)，以很好地控制生產(chǎn)。第26頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月1、例如：表8-2日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析項(xiàng)目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時(shí)罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94三、染菌原因第27頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月表6-3國內(nèi)一制藥廠染菌原因分析

項(xiàng)目百分率%種子帶菌14.15盤管穿孔14.20閥門滲漏23.30空氣系統(tǒng)有菌10.0管理不善25.80原因不明5.78其它7.49第28頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月管理不善而染菌的有31個(gè)罐批，占25.08％經(jīng)分析有下表所列原因：

項(xiàng)目百分率%進(jìn)罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查25.8接種違反操作規(guī)程25.8檢修質(zhì)量缺乏驗(yàn)收制度19.35操作不熟練19.35配料違反工藝規(guī)程6.45調(diào)度不當(dāng)3.25表8-4管理不善染菌的原因第29頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月表8-5國內(nèi)一抗生素生產(chǎn)廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析

項(xiàng)目百分率%外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料）8.20設(shè)備穿孔7.60空氣系統(tǒng)有菌26.00停電罐壓跌零1.60接種11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足0.60管理問題7.80操作違反規(guī)程1.60種子帶菌0.60原因不明35.00第30頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月2、造成染菌的主要原因總結(jié)（1）種子帶菌-P233

種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。第31頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）、空氣帶菌-P233

無菌空氣帶菌是發(fā)酵染菌的主要原因之一（19.96％，26%）。國內(nèi)外空氣除菌技術(shù)雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率降低到理想的程度。因?yàn)榭諝獬到y(tǒng)較為復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會(huì)導(dǎo)致空氣除菌失敗。（3）、設(shè)備滲漏-P234設(shè)備滲漏包括冷卻夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。（33.85％，37.5％）。所以說加強(qiáng)設(shè)備本身及附屬零部件的嚴(yán)密度檢查。第32頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）、滅菌不徹底滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時(shí)間蒸汽總壓是否達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別原材料儲(chǔ)存和保管，如玉米漿、母液糖等有機(jī)原料——雜菌的數(shù)量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設(shè)備的清洗質(zhì)量——有無滅菌的死角第33頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）、生產(chǎn)技術(shù)管理不善技術(shù)管理就是要對(duì)發(fā)酵每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制，必須制定嚴(yán)格工藝衛(wèi)生管理制度。否則發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理第34頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月四、發(fā)酵染菌原因分析1、染菌的雜菌種類分析雜菌原因耐熱的芽孢桿菌培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備存在死角等球菌、酵母、無芽孢桿菌等種子帶菌、空氣過濾效率低、除菌不徹底、發(fā)酵罐的冷卻管或加套等設(shè)備滲漏、操作問題等真菌無菌室滅菌不徹底、無菌操作不當(dāng)、滅菌不徹底等表8-6染菌的雜菌種類分析第35頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月2、發(fā)酵染菌的規(guī)模分析染菌時(shí)期原因發(fā)酵前期種子帶菌、連消設(shè)備染菌發(fā)酵中、后期如雜菌類型相同，一般是空氣凈化系統(tǒng)存在空氣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)不合理、空氣過濾介質(zhì)失效或效率下降等問題表8-7大批量發(fā)酵罐染菌（情況較少，危害較大）第36頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月表8-8部分發(fā)酵罐染菌

染菌時(shí)期原因發(fā)酵前期種子帶菌、滅菌不徹底發(fā)酵后期中間補(bǔ)料染菌，如補(bǔ)料液帶菌、補(bǔ)料管滲漏，或油管系統(tǒng)發(fā)生問題個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌（如果采用間歇滅菌工藝，一般不會(huì)發(fā)生）：大都由于設(shè)備滲漏造成（設(shè)備的腐蝕磨損所引起的染菌會(huì)出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時(shí)間向前推移的現(xiàn)象，），應(yīng)仔細(xì)檢查閥門、罐體或罐器是否清潔等。第37頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月3、不同污染時(shí)間分析

（1）、染菌發(fā)生在種子培養(yǎng)階段，或稱種子培養(yǎng)期染菌。通常是由種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底，以及接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素等原因而引起染菌。（2）在發(fā)酵過程的初始階段發(fā)生染菌，或稱發(fā)酵前期染菌。大部分也是由于種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底，以及接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素、無菌空氣等原因而引起。（3）發(fā)酵后期染菌大部分是由空氣過濾不徹底、中間補(bǔ)料染菌、設(shè)備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題而引起。第38頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)發(fā)酵過程染菌的防止一、種子帶菌的原因及防止1、帶菌的原因（1）無菌室的無菌條件不符合要求；（2）培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底；（3）操作不當(dāng)（移接、培養(yǎng)過程中受污染）。2、種子帶菌的防治（1）無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內(nèi)要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學(xué)藥品滅菌。第39頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌室要求接種、移種等無菌操作需要在無菌室內(nèi)進(jìn)行。無菌室面積不宜過大，一般約4~6m2高約2.6米。為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有1~3個(gè)套間(緩沖過道)(參照下圖)。無菌室內(nèi)部的墻壁、天花板要涂白漆或采用瓷磚，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形，便于揩擦清洗以減少空氣中微生物的潛伏場所，室內(nèi)布置應(yīng)盡量簡單，最好能安裝空氣調(diào)節(jié)裝置，通入無菌空氣并調(diào)節(jié)室內(nèi)的溫濕度。

在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時(shí)，關(guān)燈后15分鐘再接種。用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，開啟超凈臺(tái)的通風(fēng)，接種時(shí)必須在超凈臺(tái)上操作，超凈臺(tái)裝有一臺(tái)鼓風(fēng)機(jī)，進(jìn)風(fēng)口有一粗過濾器，出風(fēng)口有高效過濾器，保證無菌風(fēng)從超凈臺(tái)吹出，外界有菌空氣不可能進(jìn)入接種區(qū)域，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。第40頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月 無菌室內(nèi)無菌度的要求是：把無菌培養(yǎng)皿平板打開蓋子在無菌室內(nèi)放置30分鐘，根據(jù)一般工廠的經(jīng)驗(yàn)，長出的菌落在3個(gè)以下為好。在種子的無菌條件不要求很高的情況下，可以不采用無菌室而直接用無菌箱進(jìn)行操作，但無菌要求很高的情況下，即使在無菌室內(nèi)還要用無菌箱操作。第41頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）在制備種子時(shí)對(duì)砂土管、斜面、三角瓶及搖瓶均嚴(yán)格進(jìn)行管理（3）對(duì)每一級(jí)種子的培養(yǎng)物均應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的無菌檢查（4）對(duì)菌種培養(yǎng)基或器具進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理第42頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月二、空氣帶菌及其防治必須從空氣的凈化工藝和設(shè)備的設(shè)計(jì)、過濾介質(zhì)的選用和裝填、過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統(tǒng)。1、加強(qiáng)生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生管理，減少生產(chǎn)環(huán)境中空氣的含菌量。2、設(shè)計(jì)合理的空氣預(yù)處理工藝，盡可能減少生產(chǎn)環(huán)境中空氣帶油、水量，提高進(jìn)入過濾器的空氣溫度，降低空氣的相對(duì)濕度，保持過濾介質(zhì)的干燥狀態(tài)，防止空氣冷卻器漏水，防止冷卻水進(jìn)入空氣系統(tǒng)等。第43頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月3、設(shè)計(jì)和安裝合理的空氣過濾器，防止過濾器失效。選用除菌效率高的過濾介質(zhì)，在過濾器滅菌時(shí)要防止過濾介質(zhì)被沖翻而造成短路，防止過濾介質(zhì)的裝填不均而使空氣走短路，保證一定的介質(zhì)充填密度。在操作中要防止空氣壓力的劇變和流速的急增。第44頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月三、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治淀粉質(zhì)原料容易結(jié)塊“夾生”攪拌混合或加入一定量的α-淀粉酶或罐外預(yù)先配料混均滅菌時(shí)壓力表顯示“假壓”打開排氣閥門及有關(guān)聯(lián)接管的邊閥、壓力表接管邊閥等排汽培養(yǎng)基滅菌中產(chǎn)生泡沫添加消泡劑工人操作不當(dāng)加強(qiáng)技術(shù)培訓(xùn)和責(zé)任心教育第45頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月四、設(shè)備滲漏或“死角”造成的染菌及其防治發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，物料與設(shè)備摩擦造成機(jī)械磨損以及加工制作不良等原因會(huì)導(dǎo)致設(shè)備及附件形成微小漏孔所發(fā)生的滲漏現(xiàn)象。1、發(fā)酵罐的滲漏（1）冷卻管的滲漏是發(fā)酵罐中最容易滲漏的部件之一，氣壓試驗(yàn)和水壓試驗(yàn)（2）罐體的穿孔

每年大修時(shí)需檢查鋼板減簿的程度。有夾套的發(fā)酵罐可在夾套內(nèi)用水壓或氣壓的試驗(yàn)方法檢查罐壁有無滲漏。發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢罐底的加強(qiáng)板第46頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月2、管件的滲漏（1）閥據(jù)統(tǒng)計(jì)，因閥的滲漏引起的染菌占染菌率的比例很大，采用密封性較高的閥門。目前使用的大小閥門大多采用截止閥和橡膠隔膜閥。

1)嚴(yán)密不漏。2)無填料。3)閥結(jié)構(gòu)為流線型，流量大，阻力小，無死角，無堆積物，在關(guān)閉時(shí)不會(huì)使緊密面軋壞。4)檢修方便。但須定期檢查隔膜有否老化及脫落。

第47頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月2、管路的連接管子的連接有螺紋連接、法蘭連接和焊接三種。3、管路的配置排氣管與下水管第48頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月第49頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月4、發(fā)酵罐與管件的死角所謂死角是指滅菌時(shí)因某些原因使滅菌溫度達(dá)不到或不易達(dá)到的局部地區(qū)。（1）法蘭連接的死角法蘭的“死角”a—墊圈內(nèi)徑過小；b—墊圈內(nèi)徑過大；c—法蘭不平造成的泄漏與“死角”第50頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）渣滓在罐底與用環(huán)式空氣分布管所形成的死角圖A圖B圖C第51頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）不銹鋼襯里的死角小型發(fā)酵罐通常采用不銹鋼制造。對(duì)于大型發(fā)酵罐，一般都采用不銹鋼襯里的方法。可采用復(fù)合鋼板(將兩種不同材質(zhì)的鋼板軋合為一體的鋼板)制造發(fā)酵罐。不銹鋼襯里破裂造成“死角”第52頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)接種罐管路的死角滅菌時(shí)蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法第53頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月(6)壓力表安裝不合理形成的死角

另外，須注意罐內(nèi)結(jié)垢形成的死角，對(duì)于不銹鋼罐及普通碳鋼罐的處理不同。壓力表安裝不合理形成“死角”1,6—發(fā)酵罐；2—緩沖管；3,4—壓力表；5—旋塞第54頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月5、設(shè)備與管道的清洗與殺菌管件和閥門清洗清水漂洗5～10min常溫洗滌劑洗滌15～20min常溫～70℃清洗漂洗常溫5～10min消毒劑處理15～20min常溫清水漂洗(15～20min，常溫)第55頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月CIP清洗系統(tǒng)定義：

CIP，是英文Clean-In-Place的縮寫，即就地清洗或稱為原位清洗,其定義為不拆卸設(shè)備或元件,在密閉的條件下,用一定溫度和濃度的清洗液對(duì)清洗裝置加以強(qiáng)力作用,使與食品接觸的表面洗凈和殺菌的方法。第56頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月與傳統(tǒng)的手工拆卸機(jī)器零件的清洗方式相比,CIP的優(yōu)點(diǎn)主要有:(1)能維持一定的清洗效果,保證產(chǎn)品的安全性。

(2)節(jié)約操作時(shí)間、提高效率,以實(shí)現(xiàn)商業(yè)的最大利潤。

(3)節(jié)省勞動(dòng)力,保證操作的安全性。

(4)節(jié)省清洗用水和蒸汽。相比之下,常規(guī)拆卸清洗的缺點(diǎn)是:費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,易損壞聯(lián)接件;設(shè)備停機(jī)時(shí)間長,設(shè)備利用率低;清洗不徹底,有時(shí)對(duì)操作者也不十分安全。

CIP的優(yōu)點(diǎn)第57頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月清洗程序分7個(gè)步驟：

㈠預(yù)沖洗：30s，10次；㈡堿預(yù)洗：16分；㈢中間清洗：清水4分；㈣清水噴沖：3次，每次30S；㈤堿噴沖：15分；㈥清水沖洗；㈦酸性水沖洗。第58頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月6、設(shè)備及管路的殺菌發(fā)酵罐及容器的殺菌過程容器的氣密性試驗(yàn)，打開所有的冷凝水排除閥，開啟進(jìn)蒸汽閥。一定壓強(qiáng)后，打開排空氣閥，把容器中原有的空氣排除干凈。當(dāng)罐內(nèi)壓強(qiáng)升至0.1MPa(121℃)，計(jì)滅菌時(shí)間，殺菌過程中不斷排除蒸汽管路及罐內(nèi)的蒸汽冷凝水。結(jié)束滅菌操作時(shí)，先關(guān)閉所有排污閥及排氣閥，然后關(guān)蒸汽進(jìn)口閥，打開無菌空氣進(jìn)口閥，以確保罐內(nèi)壓強(qiáng)。第59頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)備及管路的殺菌空氣分布器的蒸汽滅菌管路布置導(dǎo)流筒空氣分布器BA無菌空氣蒸汽第60頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)備及管路的殺菌浸沒管路與旁路進(jìn)口管的殺菌布管蒸汽蒸汽AB蒸汽進(jìn)料管ABC第61頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月蒸汽滅菌無菌排料ABCEDF蒸汽冷凝水排污或CIP返回排料系統(tǒng)蒸汽殺菌第62頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)備及管路的殺菌罐的CIP清洗系統(tǒng)蒸汽殺菌配管CIPABC蒸汽第63頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)備及管路的殺菌發(fā)酵罐攪拌器密封裝置的蒸汽滅菌配管第64頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)備及管路的殺菌空氣過濾器的殺菌止逆閥第65頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)備及管路的殺菌閥門的殺菌(2)隔膜閥第66頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)備及管路的殺菌取樣閥門的殺菌第67頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月保證管道徹底滅菌的設(shè)計(jì)要求管道應(yīng)有一定的斜度，通常取1/100或更大；凹陷低點(diǎn)安裝排污閥；管路有足夠的支撐點(diǎn)；盡可能減少和簡化管路，盡可能少用彎頭管件和閥門；盡可能減少最高與最低點(diǎn)，且在每個(gè)最高點(diǎn)裝設(shè)蒸汽進(jìn)管，在最低點(diǎn)均裝冷水閥；每個(gè)罐及管道盡可能分開滅菌。這樣才能保證蒸汽殺菌的嚴(yán)密性與穩(wěn)定安全性。設(shè)備及管路的殺菌第68頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月1罐2罐兩個(gè)罐及連接管的蒸汽殺菌ACBDEF第69頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月冷凝水的排放自由排放用汽水閥自動(dòng)排放利用計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制排除冷凝水設(shè)備及管路的殺菌第70頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月空罐滅菌

滅菌溫度和滅菌時(shí)間的要求是高溫長時(shí)(121℃，60分鐘)，既合理經(jīng)濟(jì)，又能殺滅設(shè)備中各死角殘存的雜菌或芽孢。

設(shè)備及管路的殺菌第71頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月通氣發(fā)酵罐清洗與滅菌管路圖止回閥第72頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月三路進(jìn)汽：在對(duì)培養(yǎng)基滅菌時(shí)，直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)間,達(dá)到培養(yǎng)基滅菌之目的。實(shí)罐滅菌的進(jìn)汽和排氣原則:“非進(jìn)即出”，就是說所有進(jìn)入發(fā)酵罐的管道在滅菌過程中如果不進(jìn)入蒸汽就一定要進(jìn)行排氣，使所有管道都被蒸汽（或二次蒸汽）通過，得以滅菌。不能有既不進(jìn)汽也不排汽的管道（死角）存在。

發(fā)酵罐實(shí)罐滅菌第73頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月四、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治1、通常對(duì)于淀粉質(zhì)培養(yǎng)基的滅菌采用實(shí)罐滅菌較好，先配料，過濾大顆粒物之后，在進(jìn)行滅菌。2、在滅菌升溫時(shí)，要打開排氣閥門，使蒸汽能通過并驅(qū)除罐內(nèi)冷空氣，一般可避免“假壓”造成染菌（自動(dòng)控溫）。3、為加快升溫速度，凡能進(jìn)蒸汽的管路在滅菌時(shí)都可同時(shí)進(jìn)汽，但各管路的阻力不同，易造成蒸汽短路現(xiàn)象，使物料受熱不勻，需調(diào)整各進(jìn)汽管的流量。4、滅菌蒸汽要求采用飽和蒸汽，冷凝水越少越好，滅菌時(shí)蒸汽壓力要求平穩(wěn)。第74頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月5、泡沫問題培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時(shí)升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。4、其他操作問題

實(shí)罐滅菌時(shí)，罐內(nèi)因蒸汽冷凝而使罐壓突然降低甚至?xí)纬烧婵眨源藭r(shí)必須將無菌空氣通入罐內(nèi)保持一定壓力，并注意壓力變化，隨時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)。5、發(fā)酵過程越來越多的采用自動(dòng)控制，一些控制儀器逐漸被應(yīng)用。一般常采用化學(xué)試劑浸泡等方法來滅菌。第75頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月五、發(fā)酵染菌后的措施1、如果種子培養(yǎng)或種子罐中發(fā)現(xiàn)污染——倒罐2、發(fā)酵早期染菌——可以適當(dāng)添加營養(yǎng)物質(zhì)，重新滅菌后再接種發(fā)酵?；虿捎眉哟蠼臃N量的辦法3、中、后期染菌，如果雜菌的生長將影響發(fā)酵的正常進(jìn)行或影響產(chǎn)物的提取時(shí)，應(yīng)該提早放罐。但對(duì)發(fā)酵液中的碳、氮源還較多，此時(shí)應(yīng)先設(shè)法使碳、氮源消耗，再放罐提取?；蛟谌揪陌l(fā)酵液內(nèi)添加抑菌劑(如小劑量的抗菌素或醛類)用以抑制雜菌的生長也是一種辦法。第76頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月5、染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅菌方法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學(xué)滅菌劑攪拌半小時(shí)，才放下水道。否則由于各罐的管道相通，會(huì)造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也會(huì)造成空氣的污染而導(dǎo)致其它罐批染菌。6、染菌厲害時(shí)，車間環(huán)境（罐內(nèi)、原料儲(chǔ)罐等）要用石灰或甲醛熏蒸消毒。7、凡染菌的罐要找染菌的原因，對(duì)癥下藥。第77頁，課件共97頁，創(chuàng)作于2023年2月六、染噬菌體的防治1、染噬菌體對(duì)發(fā)酵的影響發(fā)酵過程