第四章蛋白質(zhì)與酶的化學(xué)修飾第1頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.1、概述目前為止盡管人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種酶,但是真正具有商業(yè)價(jià)值即每年銷售額可超過1000萬美元的酶不過數(shù)十種,為什么？第2頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一、限制酶的應(yīng)用的原因

1、穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2、作用的最適條件不符。3、酶的專一性4、米式常數(shù)過大5、臨床應(yīng)用的特殊要求6、酶活性不夠高第3頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月二、改變酶特性有兩種主要的方法

1)通過化學(xué)修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。

2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。第4頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月三、酶化學(xué)修飾的概念

酶的化學(xué)修飾（chemicalmodification）：通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。酶選擇性化學(xué)修飾：描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。第5頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月四、酶化學(xué)修飾的目的

1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末）2.人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3）消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。第6頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

五、酶化學(xué)修飾的原理1、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。2、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第7頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：A大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。B酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第8頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除；“遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合。第9頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月5、酶微環(huán)境穩(wěn)定的維持pH值改變時(shí)：①破壞了酶分子上靜電形成的化學(xué)鍵，氫鍵等維持天然構(gòu)象的平衡力②改變了酶分子上氨基酸殘基的離解狀態(tài)和它們之間的相互結(jié)合及作用方式許多大分子修飾劑本身就是多聚電解質(zhì)，能在酶分子表面或微環(huán)境區(qū)域形成一層“緩沖外殼”。第10頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2、化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)一、酶性質(zhì)的了解（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等（2）酶活性中心的狀況活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等（3）酶側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)及其反應(yīng)性巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、二硫鍵、硫醚基等第11頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、修飾劑的要求1、修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度對蛋白質(zhì)的吸附性2、修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置3、修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件一般要求較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有較多反應(yīng)活性基團(tuán)；試劑的選擇—要根據(jù)修飾目的選擇第12頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月例如對氨基修飾可有幾種情況——修飾所有氨基而不修飾其它基團(tuán)；僅修飾α-氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基；修飾具有催化活性的氨基；例：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須選擇能引入最大電荷量的試劑。第13頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月用于修飾酶的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備：選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性條件下進(jìn)行；所標(biāo)記的殘基在肽鏈中穩(wěn)定以易于分離鑒定；修飾反應(yīng)的程度能簡單測定；第14頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月三、反應(yīng)條件的選擇修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。（1）pH與離子強(qiáng)度pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例第15頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月四、化學(xué)修飾的影響因素有的情況下化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變并不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(稱非必需部分的修飾);但大多情況下將導(dǎo)致生物活性的改變(如下降以至完全喪失)。影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素：1.蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性；2.修飾劑的反應(yīng)性。第16頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一）、蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的影響因素

蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)都是親核反應(yīng)。被修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的親核性與其pK值相關(guān)。影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)pK值的因素有：

1、微環(huán)境：微區(qū)極性、基團(tuán)間的氫鍵、靜電相互作用2、基團(tuán)之間的障礙（位阻效應(yīng)）3、其它因素：電荷轉(zhuǎn)移、共價(jià)鍵形成、金屬螯合、旋轉(zhuǎn)自由度等第17頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月二）、蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性超反應(yīng)性：指蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。酶的催化活性基團(tuán)通常對修飾劑是有反應(yīng)的，但酶的超反應(yīng)基團(tuán)不一定是酶活性部位上的基團(tuán)，可能與酶的功能或構(gòu)象沒有明顯聯(lián)系。第18頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月影響因素：1.改變蛋白質(zhì)功能基的pKa值；2.蛋白質(zhì)功能基具有較大的親核性；3.通過靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當(dāng)?shù)娜∠颍?.試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學(xué)適應(yīng)性；5.試劑的結(jié)合。第19頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月三）、修飾劑反應(yīng)性的決定因素1.選擇性吸附：化學(xué)修飾前，修飾劑根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附于低或高極性區(qū)的，有時(shí)可以根據(jù)對速度的飽和效應(yīng)，檢測出蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物的形成，類似酶-底物復(fù)合物。2.靜電相互作用：帶電的修飾劑能選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。該作用可使修飾劑向多功能部位中的一個(gè)殘基定位，或向雙功能基一側(cè)定位。此外，靜電排斥力能抑制修飾作用。第20頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.位阻因素：蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。但修飾的結(jié)果卻能提供蛋白質(zhì)表面的有用信息。4.催化因素：修飾部位附近的其它功能基，若起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。5.局部環(huán)境的極性：許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無關(guān)；疏水環(huán)境能阻止產(chǎn)物中電荷分離的反應(yīng)。第21頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.3、化學(xué)修飾的種類表面修飾內(nèi)部修飾與輔因子相關(guān)的修飾物理修飾親和修飾第22頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一、表面修飾化學(xué)固定化小分子修飾大分子修飾肽鏈的交聯(lián)第23頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1、化學(xué)固定化

通過酶表面的酸性或堿性氨基酸殘基將酶共價(jià)連接到惰性載體上，從而改變酶所處的環(huán)境，酶的性質(zhì)也相應(yīng)發(fā)生改變。例如：酶固定到電荷載體上，由于介質(zhì)中的質(zhì)子靠近載體，并與載體上的電荷發(fā)生作用，使酶的最適pH發(fā)生偏移。糖化酶固定到陰離子載體上，最適pH4.5升到6.5，與D-木糖異構(gòu)酶的最適pH7.5靠近，可簡化高果糖漿生產(chǎn)工藝。

載體與底物帶相同電荷，固定化后反應(yīng)系統(tǒng)Km增加，反之，Km降低。

增加酶分子構(gòu)象穩(wěn)定性。第24頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2.小分子修飾（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用各種小分子化合物。

20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。第25頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)第26頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

1)烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。第27頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月烷基化反應(yīng)第28頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

2)酰基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?。可作用基團(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）第29頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月?；磻?yīng)

第30頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3)氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。還原劑：2－巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。第31頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。第32頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

4)芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。碘代：

I2＋

+HI

硝化：

(NO2)4C++(NO2)3CH

（四硝基甲烷）第33頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾氨基修飾（Lys）羧基修飾（Asp、Glu）巰基修飾（Cys）胍基修飾（Arg）羥基修飾（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修飾（His）吲哚基修飾（Trp）甲硫基修飾（Met）二硫鍵修飾親和修飾第34頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

1）、

氨基（—NH2）修飾氨基在酶蛋白中主要是Lys的-NH2

和肽鏈末端氨基非質(zhì)子化的-NH2

親核反應(yīng)活性很高，易被選擇性修飾一般情況下-NH2

的pKa=10，其解離程度取決于微環(huán)境氨基的修飾反應(yīng)主要有N-烷基化等第35頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月乙酸酐

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)2,4一二硝基氟苯(DNFB)碘代乙酸(IAA)還原烷基化醛丹磺酞氯(DNS)乙?；姾上Х蓟姾上Х蓟姾上榛胴?fù)電荷芳基化電荷消失引入正電荷第36頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

2）、

羧基（—COOH）修飾羧基在酶蛋白中主要是Asp和Glu的側(cè)鏈—COOH，以及肽鏈的末端羧基在水溶液中，—COOH通常解離成負(fù)離子，親核性降低，對其修飾的方法有限，主要反應(yīng)為成酯、成酰胺反應(yīng)第37頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——羧基碳二亞胺反應(yīng)（羧基修飾的標(biāo)準(zhǔn)方法）R,R‘為烷基；X為鹵素碳二亞胺第38頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——羧基酯化反應(yīng)硼氟化三甲洋鹽甲醇胃蛋白酶與[14C]硼氟化三甲洋鹽在pH5時(shí)酶完全失活，研究表明兩-COOH為該酶必需基團(tuán)第39頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

3）、巰基（—SH）修飾巰基在酶蛋白中的來源是Cys的-SH巰基的親核性強(qiáng)，往往是酶分子中反應(yīng)活性最高的基團(tuán)巰基容易被氧化成—S—S—，在維持蛋白亞基之間的相互作用和酶催化過程中起重要作用巰基用烷基化試劑修飾后一般能得到穩(wěn)定的修飾產(chǎn)物第40頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——巰基二硫鍵置換反應(yīng)常用于定量測定蛋白質(zhì)分子-SH數(shù)目、研究-SH的改變程度和-SH所處的環(huán)境。4,4‘-二硫二吡啶（4-PDS）5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)

又稱Ellman試劑412nm處有強(qiáng)吸收324nm處有吸收TNB第41頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——巰基與含汞有機(jī)物的反應(yīng)（—SH對Hg的親和力很強(qiáng)）對氯汞苯甲酸(PMB)2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)250nm處有最大光吸收可容許低濃度蛋白質(zhì)的光譜定量分析第42頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——巰基S-烷基化反應(yīng)N一乙基馬來酰亞胺(NEM)碘代乙酸(IAA)同時(shí)會使氨基乙酰化300nm處有最大光吸收第43頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

4）

胍基（—N=C(NH2)2）修飾胍基存在于酶蛋白的Arg殘基側(cè)鏈上在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起重要作用胍基堿性強(qiáng)，難以和大多數(shù)試劑反應(yīng)，一般采用具有兩個(gè)鄰位羰基的化合物，在中性或弱堿性條件下反應(yīng)，一般是可逆反應(yīng)第44頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——胍基（與鄰二酮的反應(yīng)）丁二酮硼酸鹽1,2-環(huán)己二酮硼酸鹽苯乙二醛需在黑暗中進(jìn)行,因其可作為光敏劑破壞Trp\His\Tyr等殘基第45頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

5）、酚基和羥基（—OH）修飾酶蛋白中含羥基的氨基酸殘基有：Ser、Thr、Tyr羥基的專一性修飾較困難，通常修飾劑能同時(shí)修飾羥基、氨基和巰基Tyr的酚羥基相比于Ser和Thr的羥基要活潑一些，更容易發(fā)生修飾；酚基具有芳香性，能發(fā)生親電取代反應(yīng)第46頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——酚基和酚羥基酚基親電取代反應(yīng)碘化反應(yīng)四硝基甲烷(TNM)第47頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——（酚）羥基O-?；磻?yīng)N-乙酰咪唑二異丙基氟磷酸(DFP)第48頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

6）、

咪唑基修飾咪唑基存在于酶蛋白的His殘基側(cè)鏈上His是多種酶的活性中心，是電荷中繼網(wǎng)中的重要成員對His咪唑基的修飾，一般是通過N-烷基化或C-親核取代來進(jìn)行對咪唑進(jìn)行修飾后，酶活性一般會受到顯著影響第49頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——咪唑基N-取代反應(yīng)焦碳酸二乙醋（DPC）碘乙酸DPC是最常用的His殘基的修飾試劑,，

使His殘基的咪唑基上1個(gè)N羧乙基化,并使得在240nm處的光吸收增加。在堿性條件下該取代反應(yīng)是可逆的。第50頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——咪唑基雜環(huán)上的親電取代反應(yīng)碘化反應(yīng)第51頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

7）、吲哚基修飾吲哚基存在于酶蛋白的Trp殘基側(cè)鏈上Trp殘基疏水性較強(qiáng)，一般位于酶分子的內(nèi)部，反應(yīng)活性比氨基和巰基差，因此對其修飾較困難，很多能與吲哚基反應(yīng)的試劑，一般優(yōu)先與巰基或氨基反應(yīng)。有時(shí)候Tyr會對吲哚基的修飾產(chǎn)生干擾第52頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——吲哚基與Koshland試劑的反應(yīng)水溶性差,使修飾反應(yīng)較難進(jìn)行410nm有光吸收,可測定修飾程度或Trp殘基定量2-羥基-5-硝基芐基或Koshland試劑(HNBB)4一硝基苯硫氯這些試劑也非常容易與巰基作用，因此修飾色氨酸殘基時(shí)需要對巰基進(jìn)行保護(hù)。第53頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

8）、

甲硫基修飾酶蛋白中

Met殘基中的硫以硫醚的形式存在硫醚中的硫原子雖然具有親核性，但反應(yīng)活性較差，在溫和的條件下一般不發(fā)生反應(yīng)硫醚的主要反應(yīng)主要是氧化反應(yīng)，產(chǎn)物為砜和亞砜；另外，采用某些試劑也可以進(jìn)行S-烷基化反應(yīng)第54頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

修飾反應(yīng)——甲硫基

過氧化氫過甲酸碘乙酰胺第55頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月9）、二硫鍵的修飾同-SH類似,-S-S-具有其特有的特性,可用來進(jìn)行特異的修飾,通常是通過還原的方法.這些方法通常與某些-SH修飾方法結(jié)合,以阻止再氧化成-S-S-或計(jì)算斷裂開的-S-S-數(shù)目。常用的有:巰基乙醇(具高度選擇性和長的半衰期.但要有變性劑,且使用大大過量的巰基乙醇)、Cleland試劑包括二硫蘇糖醇(DTT)及其差向異構(gòu)體二硫赤蘚糖醇(DTE)(勿需過量還原劑)。-S-S-經(jīng)還原成為-SH，一般情況下很容易自動氧化，故需經(jīng)過羧甲基處理防止重新氧化。第56頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月第57頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、乙酸酐、醛Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺、硼氟化三甲洋鹽、甲醇Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺Met硫醚基碘乙酰胺

各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑第58頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋孩偃魏我环N修飾劑不是絕對專一的。②有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化——失活，不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。③不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。第59頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月10）、親和修飾親和修飾，酶的專一性修飾用于酶化學(xué)修飾的試劑，即使對某一基團(tuán)反應(yīng)是專一的，也仍然有多個(gè)同類殘基與之反應(yīng)，因此對某個(gè)特定殘基的選擇性修飾比較困難，為了解決此問題，開發(fā)了親和標(biāo)記試劑這類修飾劑也稱為位點(diǎn)專一性抑制劑，一般具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，對酶活性部位具有高度的親和性，可專一性標(biāo)記于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也稱專一性不可逆抑制劑第60頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

第61頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

親和標(biāo)記試劑的特點(diǎn)在使酶不可逆失活以前，要與酶形成可逆復(fù)合物親和試劑的修飾程度是有限的競爭性類似物的存在會降低修飾反應(yīng)速率親和試劑體積不能太大，否則造成較大的空間位阻修飾產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定，應(yīng)便于表征和定量第62頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

KS

型（競爭性標(biāo)記試劑）根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，具有與底物結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合基團(tuán)，同時(shí)還具有能與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的活性基團(tuán)特點(diǎn)底物、競爭性抑制劑及其他結(jié)構(gòu)類似物對修飾具有保護(hù)作用修飾反應(yīng)是定量定點(diǎn)進(jìn)行的Kcat

型（自殺性標(biāo)記試劑）根據(jù)酶催化過程設(shè)計(jì)，專一性很高具有酶的底物性質(zhì)，還有一個(gè)潛在的反應(yīng)基團(tuán)在酶催化下活化，與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)，不可逆地結(jié)合第63頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3.大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）

是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。

（1）定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。（2）修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。

修飾方法：非共價(jià)修飾、共價(jià)修飾。第64頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月非共價(jià)修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。第65頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。第66頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月共價(jià)修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。第67頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月大分子修飾(共價(jià))的過程修飾劑的選擇↓修飾劑的活化↓修飾蛋白質(zhì)↓將修飾劑與蛋白分離第68頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1）聚乙二醇及其修飾反應(yīng)

聚乙二醇的特點(diǎn)：①線性分子(HO-CH2-CH2-O-CH2)n-CH2-OH；②具有良好的生物相容性和水溶性；③在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性；④末端活化后可與酶產(chǎn)生交聯(lián)；⑤覆蓋在酶分子表面形成疏松的親水外殼，導(dǎo)致流體動力學(xué)發(fā)生改變。第69頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月聚乙二醇作為修飾劑應(yīng)注意的問題：①PEG分子量為750~5000的修飾效果較好，用甲氧基PEG效果更好；②修飾效果還與所用活化劑與酶的配比有關(guān)，PEG:E=15~50:1→40%活力保持。③應(yīng)盡量選擇對酶活性影響小的修飾方法。第70頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月修飾反應(yīng)疊氮法將PEG的末端羥基轉(zhuǎn)化為疊氮基，然后與酶反應(yīng)。琥珀酸酐法用二溴代琥珀酸酐在溫和堿性條件下將PEG活化，經(jīng)減壓濃縮得活化PEG，可與酶分子上氨基交聯(lián)。第71頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月三氯均嗪法PEG經(jīng)三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或減壓蒸餾，制得活化PEG。羰二亞胺法修飾酶分子上的羧基重氮法將PEG末端羥基轉(zhuǎn)換成重氮基團(tuán)，再在弱堿性條件下修飾酶分子中的酚基、咪唑基。第72頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2）糖類的修飾反應(yīng)

溴化氰法右旋糖苷經(jīng)溴化氰活化后，在堿性條件下與酶的游離氨基共價(jià)連接，生成修飾酶。高碘酸氧化法高碘酸將右旋糖苷上鄰雙羥基氧化成醛基，醛基再與酶分子上的氨基結(jié)合而生成修飾酶。第73頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

4、肽鏈交聯(lián)采用雙功能基團(tuán)化合物（雙功能試劑），在酶分子中對空間距離較近的兩個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)之間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)第74頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月雙功能試劑：指具有兩個(gè)反應(yīng)活性部位，分為同型雙功能交聯(lián)劑和異型雙功能交聯(lián)劑，可在相隔較近的兩個(gè)氨基酸殘基間搭橋、形成多肽鏈內(nèi)、鏈間或蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，而不引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的重大改變的試劑。雙功能試劑還可將一蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到一個(gè)化學(xué)惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白質(zhì)。表征交聯(lián)在一起的氨基酸殘基或蛋白質(zhì)，可提供許多關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)間相互作用的信息。第75頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月

側(cè)鏈基團(tuán)修飾分子內(nèi)交聯(lián)試劑同型、異型可裂解、不可裂解第76頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月第77頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月分子內(nèi)交聯(lián)增加酶分子表面交聯(lián)鍵的數(shù)目。分子間交聯(lián)用雙功能或多功能試劑使不同的酶交聯(lián)起來產(chǎn)生雜合酶。第78頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月二、內(nèi)部修飾酶蛋白主鏈修飾催化基團(tuán)的修飾肽鏈伸展后的修飾第79頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1、酶蛋白主鏈修飾酶法：酶原→酶酶蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）

利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。第80頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1、引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2、

仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3、有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。第81頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2、催化基團(tuán)的修飾定點(diǎn)突變：轉(zhuǎn)變氨基酸側(cè)鏈氨基酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法。例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的Ser轉(zhuǎn)換為Cys，修飾后該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性，因此可用于肽的合成。缺點(diǎn)：化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。第82頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3、肽鏈伸展后的修飾

先用變性劑對酶進(jìn)行變性處理，再進(jìn)行修飾，然后重新折疊成某種活性的構(gòu)象。Saraswothi等，先讓酶變性，然后加入競爭性抑制劑，待獲得所希望酶的構(gòu)象后，用戊二醛固定，然后透析除去抑制劑。他們以丙酸作競爭性抑制劑，把核糖核酸酶制成一種“酸性脂酶”，從而改變了酶的底物專一性、創(chuàng)造了新的酶活力。第83頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月三、與輔因子相關(guān)的修飾1、對依賴輔因子的酶的修飾1）、如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合，則可將輔因子共價(jià)結(jié)合到酶分子上。2）、引入新的具有強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。迄今最成功的例子是Kaiser將黃素共價(jià)結(jié)合在木瓜蛋白酶上，利用黃素的溴酰衍生物與木瓜蛋白酶的共價(jià)結(jié)合成為黃素木瓜蛋白酶，從而將蛋白酶轉(zhuǎn)變成氧化還原酶。第84頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3、金屬離子置換修飾

Metalionsubstitutemodification2、金屬酶的金屬取代可改變酶的專一性、穩(wěn)定性、抑制作用等。把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。通過修飾了解各種金屬離子在酶催化過程中的作用，闡明催化機(jī)制適用對象：金屬酶（metalloenzyme）一種結(jié)合金屬的酶，以一個(gè)或幾個(gè)金屬離子作為輔因子金屬離子或是直接參與催化作用，或是對保持酶的活性和構(gòu)象起穩(wěn)定作用金屬酶純化時(shí)仍保留著定量的功能金屬離子第85頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月常見的金屬酶及其離子種類-淀粉酶——Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脫氫酶——Zn2+過氧化氫酶——Fe2+?；被崦浮猌n2+超氧化物歧化酶——Cu2+、Zn2+細(xì)胞色素P450單加氧酶——Fe2+固氮酶——Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽過氧化物酶——Se(IV)主要的金屬離子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn等CytP450第86頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月金屬離子置換修飾的方法酶的提純除去原有金屬離子加入金屬螯合劑，如EDTA等，讓酶分子中的金屬離子與EDTA形成螯合物透析、超濾或?qū)游龀ヲ衔锛尤胫脫Q的離子加入含另一種金屬離子的溶液，酶蛋白與其結(jié)合用透析或?qū)游龅确椒ǔノ唇Y(jié)合的離子第87頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月金屬離子置換修飾的作用闡明金屬離子對酶催化作用的影響一般在活性中心的金屬離子能與底物或輔酶/輔基可逆結(jié)合，從而起到催化作用提高酶的催化效率將Zn型-淀粉酶置換成Ca型，活力可提高20%～30%增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性Fe-SOD置換成Mn-SOD后穩(wěn)定性增強(qiáng)，對NaN3

敏感性降低改變酶的動力學(xué)特性酰化氨基酸水解酶活性部位的Zn被Co置換后，酶的底物專一性（Km

值）和最適pH都顯著改變第88頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月四、物理修飾酶分子的物理修飾通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法研究極端條件下酶結(jié)構(gòu)和活性的變化物理修飾的特點(diǎn)不改變酶的組成單位及其基團(tuán)酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變——酶的一級結(jié)構(gòu)不變副鍵發(fā)生某些改變和重排——酶的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化第89頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月物理修飾的效果改變底物特異性例：羧肽酶

經(jīng)高壓處理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反應(yīng)（逆反應(yīng)）改變酶催化的最適溫度例：纖維素酶經(jīng)高壓處理，最適溫度下降，但在30～40oC條件下，活力提高了10%提高酶的穩(wěn)定性例：用鹽酸胍破壞胰蛋白酶的空間構(gòu)象，伸展肽鏈，再透析除去鹽酸胍，在不同溫度下重新構(gòu)建/恢復(fù)酶的構(gòu)象，50oC下重新構(gòu)建的酶穩(wěn)定性比天然酶提高5倍第90頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.4、修飾酶性質(zhì)的變化及原因修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)變化最適pH值熱穩(wěn)定性體內(nèi)抗原性半衰期酶動力學(xué)性質(zhì)對組織的分布能力變化第91頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月1、增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)，一般能增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性，可能的原因是多點(diǎn)交聯(lián)產(chǎn)生固定酶分子構(gòu)象的效應(yīng)PEG修飾酶在熱穩(wěn)定性上沒有明顯提高，可能由于PEG和酶是單點(diǎn)交聯(lián)酶分子內(nèi)基團(tuán)間相互作用在受熱情況下發(fā)生了變化，向熱力學(xué)上熵增加的方向變化，即從緊密有序趨于隨機(jī)松散。通過修飾后，使酶天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，減小熱振動，從而增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性

第92頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月2、保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第93頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月3、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：A大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。B酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第94頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4、最適pH值范圍擴(kuò)大一般情況下，修飾酶的最適pH范圍擴(kuò)大豬肝尿酸酶的最適pH為10.5，在pH7.4的生理環(huán)境中酶活僅剩5~10%，用白蛋白修飾后，最適pH范圍擴(kuò)大，在pH7.4時(shí)仍保留60%酶活吲哚-3-鏈烷羥化酶修飾后，最適pH從3.5增加到5.5，在pH7左右時(shí)，修飾酶活力比天然酶增加3倍，在生理環(huán)境下抗腫瘤效果比天然酶大得多可能的原因修飾酶的微環(huán)境更穩(wěn)定修飾酶被“固定”在一個(gè)更活潑的狀態(tài)第95頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月5、半衰期延長酶經(jīng)修飾增強(qiáng)了抗蛋白水解、抗抑制劑和抗失活因子的能力及對熱穩(wěn)定性提高，半衰期一般都比天然酶延長6、減弱或消除體內(nèi)抗原性有些修飾劑在消除酶抗原性上并無作用，如PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修飾酶；糖類物質(zhì)也不容易消除酶的抗原性現(xiàn)在比較公認(rèn)的是PEG和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明顯，原因可能是修飾劑破壞（共價(jià)結(jié)合）或“遮蓋”了抗原決定簇，使之抗原性減弱或消除第96頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月7、酶動力學(xué)性質(zhì)絕大多數(shù)酶經(jīng)修飾后最大反應(yīng)速度Vmax

沒有變化有些酶在修飾后，米氏常數(shù)Km

通常會增大，這可能是交聯(lián)于酶上的大分子所產(chǎn)生的空間障礙影響了底物對酶的接近和結(jié)合修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強(qiáng)和體內(nèi)半衰期的延長，能夠彌補(bǔ)Km

增大的缺陷第97頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月8、對組織的分布能力變化某些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，所帶電荷情況發(fā)生變化，改變其靜電吸附能力，或修飾酶的分子本身具有靶向性，因此使修飾酶對組織的分布能力有所改變，能在血液中被一些器官選擇性地吸收。第98頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月4.5、化學(xué)修飾的應(yīng)用理論研究方面醫(yī)藥領(lǐng)域工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用其他方面應(yīng)用第99頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月一、理論研究方面可用于以下研究：氨基酸數(shù)量與順序測定；氨基酸殘基的存在狀態(tài)；確定酶活性部位與作用機(jī)制；酶中特定基團(tuán)之間距離等。第100頁，課件共111頁，創(chuàng)作于2023年2月例1：由化學(xué)修飾而產(chǎn)生的靜電效應(yīng)改變常引起蛋白質(zhì)和水的相互作用的變化，甚至可造成蛋白質(zhì)分子之間的接觸點(diǎn)斷裂。因此不需加人尿素或胍，一些多聚體蛋白質(zhì)即選擇性地被解離成可溶性亞基。它們在水中很少發(fā)生聚集，并保持其生物活性，從而大大有利于這些蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的精確測定。第101頁