細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告細(xì)胞培養(yǎng)主要包括細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代和細(xì)胞凍存三個(gè)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)儀器及用品（一）超凈臺(tái)：槍頭：10mL、5mL、1mL、200μL、10μL；移液槍：同上，及相應(yīng)的支架；離心管：50mL、15mL、1.5mL，及相應(yīng)支架與盛皿；記號(hào)筆；PBS緩沖液；酒精棉；廢液杯×2：一個(gè)裝槍頭，一個(gè)裝廢液；封口膜；排槍卡槽；（二）細(xì)胞間：離心機(jī)：中型、小型；培養(yǎng)瓶：透氣的用于培養(yǎng)，密封的用于運(yùn)輸，培養(yǎng)皿；滅菌離心管、槍頭、凍存管等備用；毛巾、手套、口罩、酒精噴壺、滅菌超純水、除菌濾膜；100μL排槍；血球計(jì)數(shù)板、載玻片；水浴鍋；（三）冰箱：雙抗、環(huán)丙沙星；4℃：DMEM、1640、PBS、已配培養(yǎng)基；-20℃：MTT、MTS、DMSO、血清、胰酶；（四）緩沖間：CO2罐、液氮罐；（五）換衣間1.實(shí)驗(yàn)服、拖鞋、手套、口罩、酒精噴壺；二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（一）實(shí)驗(yàn)前將需要帶入的物品洗凈、高溫滅菌、噴酒精，放入傳送窗，將傳送窗與細(xì)胞間紫外開(kāi)啟殺菌半小時(shí)；（二）半小時(shí)后關(guān)閉紫外，開(kāi)啟風(fēng)閥與空調(diào)，散去臭氧，雙手用洗手液洗凈擦干后進(jìn)入換衣間，換上隔離服（若不使用超凈臺(tái)，換實(shí)驗(yàn)服即可），戴上口罩、手套噴酒精，進(jìn)入緩沖間風(fēng)浴1-3min；（三）進(jìn)入細(xì)胞間，冰箱中取出所需溶液（胰酶、培養(yǎng)基等）置于超凈臺(tái)中，開(kāi)啟超凈臺(tái)紫外，關(guān)閉傳送窗紫外，將物品取出后噴酒精后放于應(yīng)處位置；注：若是冬天，溶液應(yīng)在37℃水浴后再使用，所有物品放入超凈臺(tái)前均需再噴酒精，特別是蓋口處。三、細(xì)胞培養(yǎng)（一）細(xì)胞復(fù)蘇1.培養(yǎng)基配制：倒出50mL培養(yǎng)基，加入50mL血清，5mL雙抗（濃度10-50μg/mL環(huán)丙沙星可作用一周抑制支原體生長(zhǎng)），分裝3天夠用的培養(yǎng)基即可，所有都用封口膜封??；2.凍存液配制：1mLDMSO、2mL血清、7mL培養(yǎng)液混合；3.37℃溫育DMEM培養(yǎng)液（含雙抗和血清）。一般通過(guò)急速升溫的方法使凍存的細(xì)胞吸收水分，保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)不受影響。即取出凍存細(xì)胞放入37℃水浴槽中快速轉(zhuǎn)動(dòng)，1min內(nèi)迅速融化，避免細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶的發(fā)生。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中并加入溫育的培養(yǎng)液至10mL，900r/min離心10min，倒出上清培養(yǎng)液，再加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，重復(fù)上述操作，共離心3次，最后將細(xì)胞重懸于10mL培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放入37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。大約4~5小時(shí)后，開(kāi)啟電腦顯微鏡，培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞放于顯微鏡下觀察；注：平拿平放，不可用手觸摸瓶皿接口處，觀察細(xì)胞是否細(xì)胞貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)。換液：定時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)基狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)至12h左右貼壁，24h后可根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化和細(xì)胞生長(zhǎng)速度及形態(tài)變化選擇換液，吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，更換新培養(yǎng)基。（二）細(xì)胞傳代細(xì)胞傳代，是將培養(yǎng)的Hela細(xì)胞用胰酶消化、稀釋、分配到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程。觀察細(xì)胞瓶?jī)?nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿（細(xì)胞密度＞90%），進(jìn)行傳代。具體操作步驟如下：將37℃溫育了20min的磷酸鹽緩沖液（1×PBS）、胰酶和DMEM培養(yǎng)液（含雙抗和血清）取出，用紗布擦拭后，噴灑酒精置于無(wú)菌生物安全柜中。將培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)液倒出，移取2mL1×PBS于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃洗滌并將液體倒出，用1×PBS洗滌2次。之后加入2mL胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察至細(xì)胞輪廓分明約1~2min，倒掉胰酶，加入6mL新培養(yǎng)液，從上至下輕輕吹打，至瓶壁透明。將制得的細(xì)胞懸液分裝至2個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)齊新培養(yǎng)液至10mL/瓶。放入37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）細(xì)胞保藏凍存前一天換液，顯微鏡下觀察保證所有細(xì)胞無(wú)菌且生長(zhǎng)狀態(tài)較好，棄培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，胰酶消化后以800rpm離心5min,棄上清，適量?jī)龃嬉簯腋〖?xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為104-5個(gè)/mL，分管凍存于細(xì)胞保藏盒中。標(biāo)明保藏日期，置于4℃30min后轉(zhuǎn)到-20℃30min，再存于-80℃。四、MTT法操作（一）鋪板：將狀態(tài)良好生長(zhǎng)壯實(shí)的細(xì)胞（復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)穿3代后再用于實(shí)驗(yàn)）吸去培養(yǎng)基，PBS后用1mL胰酶消化1min，以兩倍胰酶體積即2mL培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)入離心管后，800rpm離心5min去上清，用1-2mL培養(yǎng)基輕輕吹打重懸細(xì)胞后，取10μL至血球計(jì)數(shù)板置顯微鏡下計(jì)數(shù)，鋪板的濃度一般為104-105個(gè)細(xì)胞/mL，每空100μL細(xì)胞應(yīng)有約103-104個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)后計(jì)算出添加培養(yǎng)基的量，用排槍將培養(yǎng)基與細(xì)胞混合均勻加入96孔板中，周圍用PBS密封細(xì)胞，以免培養(yǎng)基揮發(fā)；（二）配制樣品濃度：將樣品用培養(yǎng)基或PBS稀釋相應(yīng)濃度梯度，過(guò)膜除菌備用；加樣：細(xì)胞培養(yǎng)12h處于貼壁狀態(tài)后即可添加樣品，吸出原培養(yǎng)基，加入100μL新培養(yǎng)基，加入各濃度樣品（應(yīng)提前計(jì)算添加100μL培養(yǎng)基稀釋后的樣品濃度，以此為樣品終濃度），復(fù)孔3或5個(gè)，對(duì)照組換液后加入無(wú)藥品的藥品稀釋劑（培養(yǎng)基或PBS）；檢測(cè)：48h后結(jié)束培養(yǎng)，顯微鏡下拍照記錄，吸出所有液體，以每孔180μL無(wú)血清培養(yǎng)基與20μLMTS試劑混合均勻后添加，培養(yǎng)1-4h，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值；五、注意事項(xiàng)1.血球計(jì)數(shù)板數(shù)四個(gè)角計(jì)數(shù)，計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，數(shù)÷4×104，即密度：個(gè)/mL，用后酒精棉擦拭即可；2.倒出液體后可將瓶口、管口倒扣在酒精棉上除去殘留，也處理可能污染的物質(zhì)；3.排槍卡槽使用完清洗后用酒精浸泡，置于超凈臺(tái)紫外殺菌自然風(fēng)干即可；4.所有計(jì)算均在細(xì)胞間外完成，可將操作步驟或配取比例貼在超凈臺(tái)外，方便觀看；5.控制細(xì)胞時(shí)可邊傳代邊保存，傳代時(shí)調(diào)節(jié)密度，離心后棄掉半小時(shí)還未沉降至沉淀的細(xì)胞，半年內(nèi)使用放-80℃，長(zhǎng)期保存放液氮中；6.剛做完細(xì)菌實(shí)驗(yàn)或生化實(shí)驗(yàn)最好不要進(jìn)入細(xì)胞間，每天都應(yīng)觀察細(xì)胞狀態(tài)及時(shí)做處理；7.96孔板應(yīng)合理利用，時(shí)間梯度也可