抗核抗體(ANA)檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程××醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床免疫室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號:XXX生效日期：共頁第頁1.目的規(guī)范檢測血清或血漿中抗核抗體(ANA)的流程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。2.原理2．1·間接免疫熒光法(IIF)：將稀釋的血清與生物載片(反應(yīng)區(qū)內(nèi)固定有包被基質(zhì)的生物薄片)溫育，如果樣本是陽性，特異性IgG、IgA和IgM抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合。在第二次溫育時(shí)，熒光素標(biāo)記的抗人抗體與結(jié)合在生物基質(zhì)上的抗體反應(yīng)，形成熒光顯微鏡下所觀察到的特異性熒光模式。2．2·××化學(xué)發(fā)光法：預(yù)稀釋樣本中的ANA和超順磁性微粒上包被抗原反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，在磁場作用下，未結(jié)合物質(zhì)被洗滌液洗去，加入吖啶標(biāo)記的羊抗人Ig (GAM)，與第一步形成的抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，形成抗原抗體二抗復(fù)合物，再次清洗，在反應(yīng)復(fù)合物中加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液，樣本中ANA的量和分析儀發(fā)光系統(tǒng)監(jiān)測到的相對發(fā)光強(qiáng)度(RLU)成正比。3.標(biāo)本要求3．2·樣品收到后立即分離血清，不能及時(shí)測定的血清應(yīng)于2~8℃保存。4.試劑與儀器性和陽性對照，熒光顯微鏡。4．2·××化學(xué)發(fā)光法試劑與儀器：抗核抗體測定試劑盒，××化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。5.操作步驟ml PBS待測血樣本用PBS吐溫緩沖液1∶100和1∶1000稀釋。5．1．2加樣：將加樣板放在泡沫板上，將25μl稀釋后的血清樣本加至加樣板的每一反應(yīng)區(qū)上，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。5．1．3溫育：將生物載片有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里，室溫(18~PBS泡至少5min。5．1．5加樣：將20μlFITC標(biāo)記的抗人IgG(熒光二抗)加至潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)上。杯中取出生物載片，用吸水紙擦去背面和邊緣的水分后，立即蓋在加樣板的凹槽里，室溫(18~25℃)溫育30min。玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加封片介質(zhì)至蓋玻片，每一反應(yīng)區(qū)約10μl。從洗杯中取出一張生物載片，用吸水紙擦干背面和邊緣的水分。將生物載片有生物薄片的一面朝下放在已準(zhǔn)備好的蓋玻片上。6.校準(zhǔn)定期對熒光顯微鏡、化學(xué)發(fā)光儀、加樣槍進(jìn)行保養(yǎng)和校準(zhǔn)。關(guān)鍵部件更換或者維修后也需校準(zhǔn)。7.質(zhì)控7．1·間接免疫熒光法：每批次的實(shí)驗(yàn)應(yīng)帶上陰性和弱陽性(含滴度)質(zhì)控物。質(zhì)控規(guī)則 (含滴度結(jié)果)：陰性質(zhì)控物必須陰性，陽性質(zhì)控物滴度結(jié)果在上下1個(gè)滴度內(nèi)。7．2·化學(xué)發(fā)光法：質(zhì)控品至少每24h或每次定標(biāo)后測試一次；質(zhì)控品至少包含兩個(gè)濃度水平的待測定物；質(zhì)控結(jié)果應(yīng)落在可接受的范圍內(nèi)，否則結(jié)果無效。8.結(jié)果判斷NA顆粒型、核仁型和著絲點(diǎn)型(尤其在分裂期細(xì)胞清晰可見)。通常，熒光模式和核抗原的生化特性相關(guān)。表所示ANAIIF定性結(jié)果判讀熒光強(qiáng)度抗體滴度1∶10001∶10000中強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)弱中強(qiáng)弱1∶10001∶32001∶10000注：以出現(xiàn)陽性核型的最高稀釋度作為檢測結(jié)果。二維碼掃描到分析儀的主曲線校正而來。9.生物參考區(qū)間9．1·對于定量實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考區(qū)間。如用文獻(xiàn)或說明書提供的參考區(qū)加以驗(yàn)證。9．2·間接免疫熒光法：健康人血清中ANA陰性(不同試劑盒判定陽性的滴度不同，有的為≥1∶40；有的定為≥1∶80，有的則定為≥1∶100)?？梢?。≥48．0AU／ml視為有反應(yīng)性。10.性能參數(shù)性血清的結(jié)果特異性熒光強(qiáng)度基本一致，陰性血清結(jié)果為陰性。10．1．3批間差異：用2份特征性血清對3個(gè)批號的產(chǎn)品進(jìn)行檢測，陽性血清的結(jié)果特異性熒光強(qiáng)度基本一致，陰性血清結(jié)果為陰性。11.臨床意義ANA可以用來篩選自身免疫性疾病。ANA在不同的自身免疫性疾病中出現(xiàn)不同組合，可形成各種疾病或疾病亞群的特征性抗體譜。因此總的ANA檢測在臨床診斷與鑒別診斷中是一個(gè)極為重要的篩選實(shí)驗(yàn)，ANA陽性者進(jìn)一步檢測各亞類ANA抗體對明確診斷、臨床分型、病情