iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要內(nèi)容iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)介iTRAQ試劑標(biāo)記原理iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢(shì)iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例iTRAQ實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟主要內(nèi)容iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)介iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)介iTRAQ技術(shù)是由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)2004年開(kāi)發(fā)的同重標(biāo)簽標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術(shù)。iTRAQ試劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基）連接的胺標(biāo)記同重元素。在一級(jí)質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在一級(jí)質(zhì)譜中，不同來(lái)源的相同肽段表現(xiàn)為一個(gè)峰；在二級(jí)質(zhì)譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異；同時(shí)，肽段的MS/MS結(jié)果結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以鑒定出相應(yīng)的蛋白種類。iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)介iTRAQ技4NCBI截止現(xiàn)在為1773篇4NCBI截止現(xiàn)在為1773篇5相關(guān)雜志對(duì)重復(fù)性要求5相關(guān)雜志對(duì)重復(fù)性要求※首選2-3次生物重復(fù)，最好3次或以上組內(nèi)樣品個(gè)體差異大的材料需要更多的生物重復(fù)生物學(xué)重復(fù)樣品較多時(shí)，可以適當(dāng)混合以減少樣品數(shù)目無(wú)任何重復(fù)，可以結(jié)合其他技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證6建議※首選2-3次生物重復(fù)，最好3次或以上6建議iTRAQ試劑標(biāo)記原理報(bào)告部分共有8種：質(zhì)量數(shù)分別為114~121Da，因此iTRAQ最多可同時(shí)標(biāo)記8組樣品（客戶可按需選擇標(biāo)記個(gè)數(shù)）。肽反應(yīng)部分：能與肽鏈N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接，從而將報(bào)告部分和平衡部位標(biāo)記到肽段上，幾乎可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)。平衡部分：質(zhì)量數(shù)分別為31~24Da，與報(bào)告部分相互配合，保證iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本的同一肽段具有相同的質(zhì)荷比。iTRAQ試劑標(biāo)記原理報(bào)告部分共有8種：質(zhì)量數(shù)分別為114圖1iTRAQ技術(shù)原理圖圖1iTRAQ技術(shù)原理圖iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢(shì)靈敏度高：可檢測(cè)出低豐度蛋白；分離能力強(qiáng):可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等；適用范圍廣：可以對(duì)任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，特別適用于采用多種處理方式或來(lái)自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析；結(jié)果可靠：定性與定量同步進(jìn)行，同時(shí)給出每一個(gè)組分的相對(duì)表達(dá)水平、分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；自動(dòng)化程度高：液質(zhì)連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好。iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢(shì)靈敏度高：可檢測(cè)出低豐度蛋白；iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程。

1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質(zhì)；

2：蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)還原，封閉后用胰蛋白酶酶切；

3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標(biāo)記；

4：等量混合各樣本中的標(biāo)記肽段；

5：MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)及分析。iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程。iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例1:提取各組蛋白質(zhì)、定量并用胰酶酶切；2.各組肽段分別用4種iTRAQ試劑標(biāo)記(例如對(duì)照組用iTRAQ117標(biāo)記，其他3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別用iTRAQ114,115,116標(biāo)記)；3.標(biāo)記好的各組樣本等量混合，液相分離和質(zhì)譜分析.

4:不同樣本中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)可通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜中iTRAQ試劑的峰面積確定，如圖所示：與對(duì)照組相比，該蛋白在3個(gè)處理組(114-116)中的相對(duì)表達(dá)量較高。5.根據(jù)該肽段的二級(jí)質(zhì)譜峰圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到蛋白的定性信息。iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例1:提取各組蛋白質(zhì)、定量并用胰酶酶切案例1：人腦脊液（客戶文章未發(fā)表，資料僅供內(nèi)部參考）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：1.客戶用ELISA方法檢測(cè)正常人與病患腦脊液中幾個(gè)細(xì)胞因子存在穩(wěn)定差異2.客戶提供4種不同患者腦脊液樣本進(jìn)行iTRAQ檢測(cè)分析。3.首先對(duì)其中一例樣本進(jìn)行SDS分析，可見(jiàn)腦脊液中存在高峰度蛋白。4.除去高峰度部分蛋白，其他條帶切膠合并酶切提取。（也可以使用商品化去除高峰度試劑盒，成本較高，效果也因人而異。）案例1：人腦脊液（客戶文章未發(fā)表，資料僅供內(nèi)部參考）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果4列樣本共鑒定到861個(gè)蛋白，其中ELISA檢測(cè)到的細(xì)胞因子也得到驗(yàn)證結(jié)果4列樣本共鑒定到861個(gè)蛋白，其中ELISA檢測(cè)到的細(xì)胞4組結(jié)果兩兩比較，篩選1.2倍以上差異，4組結(jié)果兩兩比較，篩選1.2倍以上差異，數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)交蓋圖數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)交蓋圖數(shù)據(jù)分析GO富集分析通過(guò)生物信息學(xué)分析工具DAVID對(duì)鑒定蛋白進(jìn)行GO（GeneOntology，詳細(xì)信息見(jiàn)網(wǎng)站：）功能注釋、功能富集分析及定位分析。（可按照客戶要求繪制餅圖等）數(shù)據(jù)分析GO富集分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析Pathway通路富集分析在生物體內(nèi)，存在著大量的代謝、調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，這些過(guò)程往往形成一條條不同的通路（pathway），基于Pathway的分析有助于了解發(fā)生差異變化蛋白質(zhì)所的生物學(xué)進(jìn)程位置。KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)（Kanehisa，2008），通過(guò)Pathway分析能確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。通路富集結(jié)果：數(shù)據(jù)分析Pathway通路富集分析案例2。蜂王漿提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)背景：客戶把從蜂王漿中提取到的一種化合物與人的腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察到其抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力。由此猜想，此化合物有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：對(duì)照組（2重復(fù)），模型組（3重復(fù)），給藥組（3重復(fù)）實(shí)驗(yàn)過(guò)程：8組樣本分別提取總蛋白定量，酶切后標(biāo)記混合。之后進(jìn)行液相粗分離，最后QE質(zhì)譜檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源:人類UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)。質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索采用PD搜索引擎共鑒定到蛋白4565個(gè)。差異蛋白分組進(jìn)行比較。（判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的標(biāo)準(zhǔn)為鑒定到的總蛋白數(shù)是否達(dá)到文獻(xiàn)水平，差異蛋白數(shù)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)，無(wú)法承諾。）標(biāo)記樣品組113實(shí)驗(yàn)組1（對(duì)照）114實(shí)驗(yàn)組1（對(duì)照）115實(shí)驗(yàn)組2116實(shí)驗(yàn)組2117實(shí)驗(yàn)組2118實(shí)驗(yàn)組3119實(shí)驗(yàn)組3121實(shí)驗(yàn)組3案例2。蜂王漿提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)背景：客戶把從蜂王漿數(shù)據(jù)分析采用DAVID在線工具對(duì)顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。（PAHTWAY無(wú)顯著富集）數(shù)據(jù)分析采用DAVID在線工具對(duì)顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能客戶關(guān)注的信號(hào)通路（pathway）客戶關(guān)注的信號(hào)通路（pathway）iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)資料課件iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)資料課件

差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用MetaCore軟件，對(duì)所有顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，。相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，差異表達(dá)蛋白富集到30條經(jīng)典子網(wǎng)絡(luò)，右為包含“SP1,TRAP230,Neprilysin,MIF,SLC38A2”等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的子網(wǎng)。 差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用MetaCore軟件，對(duì)總結(jié)總結(jié)：iTRAQ技術(shù)及后期分析可以幫助客戶很好地驗(yàn)證試驗(yàn)猜想，以及為揭示蛋白表達(dá)變化原因提供可靠的方向指引?？偨Y(jié)總結(jié)：iTRAQ技術(shù)及后期分析可以幫助客戶很好地驗(yàn)證試驗(yàn)高階（客制化）信息分析詳見(jiàn)信息分析PDF高階（客制化）信息分析詳見(jiàn)信息分析PDFiTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟—ABI試劑盒iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟—ABI試劑盒iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟1：蛋白質(zhì)提取

可以選擇提取蛋白質(zhì)常用的各種溶液，裂解液里最好不要包括下面試劑，因?yàn)檫@些試劑會(huì)干擾iTRAQ試劑的標(biāo)記反應(yīng)。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟1：蛋白質(zhì)提取iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)資料課件iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)資料課件iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟2：蛋白質(zhì)定量

(1)可以采用Bradford方法及其他方法定量初步

(2)定量取各組樣本的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-APGE電泳，銀染定量，根據(jù)每個(gè)涌道染色情況微調(diào)蛋白濃度，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中每組樣本的蛋白量相同。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟2：蛋白質(zhì)定量iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟3：酶切，標(biāo)記每組樣本（各100μg）分別加入-20℃預(yù)冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20℃沉淀30min~4h（根據(jù)樣品所需沉淀量選擇時(shí)間，一般開(kāi)始時(shí)可選1小時(shí)）；12000rpm離心15分鐘，棄上清，用試劑盒中自帶的溶解液dissolutionbuffer（20μL）和1%SDS(1μL)充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2μL，混勻，60℃反應(yīng)1h；加入半胱氨酸封閉試劑（cystineblockingregent）1μL,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質(zhì)=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解過(guò)夜（16h）；113,114,115,116,117,118,119,121各管標(biāo)記試劑中加入50μL異丙醇(試劑盒中自帶），混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應(yīng)1h，之后各加入3倍體積的水，使標(biāo)記試劑分解。標(biāo)記和樣品對(duì)應(yīng)關(guān)系如下:4R—117,未知—118，BOO6—119,11R—121；合并各管標(biāo)記好的樣品，真空冷凍干燥。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟3：酶切，標(biāo)記iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟4：除鹽，此步操作是將標(biāo)記過(guò)程中的標(biāo)記試劑和相關(guān)buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。（1）100%乙腈沖洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上（4）0.1%TFA沖洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脫下樣品（6）將樣品冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)分析。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟4：除鹽，此步操作是將標(biāo)記過(guò)程中的標(biāo)iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟5:

第一維強(qiáng)陽(yáng)離子柱(SCX)分離（1）儀器及試劑：<1>色譜儀20AD(島津)<2>真空離心濃縮機(jī)(ChristRVC2-25，Christ，Germany)

<3>磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán))

<4>氯化鉀(國(guó)藥集團(tuán))

<5>乙腈ACN(Fisher)（2）具體操作參數(shù)柱子信息：Polysulfoethylcolumn,2.1mm*100mm,5u,200A,TheNestGroup,Inc.MAA相：10mMKH2PO4，25%CAN，PH2.6B相：10mMKH2PO4，350mMKCl，25%ACN，PH2.6

紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm/280nm

流速：200μL/min

梯度：60miniTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟5:第一維強(qiáng)陽(yáng)離子柱(SCX)分離B%從5分鐘5%到40分鐘上升至25%Time(min)B%0 05 540254580508051060stop根據(jù)峰型和時(shí)間共收取20個(gè)梯度,真空離心濃縮后，用50μLRPLCA相[5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)]溶解，進(jìn)行第二維分析。B%從5分鐘5%到40分鐘上升至25%iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟6:

第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS（1）儀器及試劑<1>色譜儀20AD(島津)<2>質(zhì)譜儀QSTARXL（AppliedBiosystem,USA）<3>乙腈ACN(Fisher)<4>甲酸（TEDIA）（2）具體操作參數(shù)反相柱信息：ZORBAX300SB-C18column(5μm,300A,0.1x150m