柱色譜的原理柱色譜流出曲線；柱色譜的分離效能指標(biāo)；柱色譜在有機(jī)化合物中的應(yīng)用。柱色譜的方法：吸附柱色譜；分配柱色譜；離子交換柱色譜；凝膠柱色譜；親和柱色譜。第三章柱色譜柱色譜的原理第三章柱色譜1第一節(jié)柱色譜的原理一、柱色譜的分離原理柱色譜法是指將待分離混合物均勻地加在裝有固定相的柱子（玻璃或金屬制成）中，再加適當(dāng)?shù)娜軇ǚQ洗脫劑）沖洗，由于試樣中各組分在兩相中的分配不同，在柱中隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度不同，通過分段定量收集洗脫液而使各組分得到分離。第一節(jié)柱色譜的原理一、柱色譜的分離原理2第一節(jié)柱色譜的原理第一節(jié)柱色譜的原理3第一節(jié)柱色譜的原理二、柱色譜的分離參數(shù)1、分配系數(shù)2、柱色譜流出曲線色譜流出曲線的意義：指明樣品的組成情況和提供樣品中單組份的最少個(gè)數(shù)；說明色譜柱的分離情況：柱效，選擇性和分離度提供單組分的定性和定量依據(jù)第一節(jié)柱色譜的原理二、柱色譜的分離參數(shù)4混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應(yīng)第一節(jié)柱色譜的原理混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應(yīng)第一節(jié)柱5二、色譜柱的分離效能指標(biāo)1、柱效能2、選擇性3、分離度第一節(jié)柱色譜的原理二、色譜柱的分離效能指標(biāo)第一節(jié)柱色譜的原理6三、柱色譜在有機(jī)化合物中的應(yīng)用1、分離混合物：將含有結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)相近的幾種成分的混合物分開。2、精制化合物：在提取分離有效成分時(shí)，去除結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)。3、鑒定化合物：在一定條件下，純的有機(jī)化合物有一定的保留值，利用標(biāo)準(zhǔn)品的對照通過色譜法來確定化合物。第一節(jié)柱色譜的原理三、柱色譜在有機(jī)化合物中的應(yīng)用第一節(jié)柱色譜的原理7按分離原理可將柱色譜分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等。現(xiàn)在作分別介紹。一、吸附色譜1、基本原理：（1）物理吸附又稱表面吸附，是因構(gòu)成溶液的分子（含溶質(zhì)及溶劑）與吸附劑表面分子的分子間里的相互作用所引起的。a)基本規(guī)律：“相似者易于吸附”。

b)基本特點(diǎn)：無選擇性、可逆吸附、快速。

c)基本原理：吸附與解吸附的往復(fù)循環(huán)。

d)三要素：吸附劑、溶質(zhì)(被分離物)、溶劑。第二節(jié)柱色譜的方法按分離原理可將柱色譜分為吸附色譜、分配色譜、離子交換8（2）化學(xué)吸附a)基本特點(diǎn)：有選擇性、不可逆吸附。

b)基本原理：產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)與Al2O3發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；堿性物質(zhì)與硅膠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；Al2O3容易發(fā)生結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化，應(yīng)盡量避免。第二節(jié)柱色譜的方法（2）化學(xué)吸附第二節(jié)柱色譜的方法9（3）半化學(xué)吸附1）基本特點(diǎn)：介于物理吸附和化學(xué)吸附之間。2）基本原理：以氫鍵的形式產(chǎn)生吸附。如聚酰胺對黃酮類、醌類等化合物之間的氫鍵吸附，力量較弱，介于前兩者之間，也有一定的應(yīng)用。第二節(jié)柱色譜的方法（3）半化學(xué)吸附第二節(jié)柱色譜的方法102、影響吸附柱色譜分離效果的因素

吸附劑的性質(zhì)

溶劑的極性

被分離物質(zhì)的極性3、吸附柱色譜的操作技術(shù)

色譜柱、吸附劑和洗脫劑的選擇4、應(yīng)用實(shí)例黃酮類化合物的分離P108第二節(jié)柱色譜的方法返回2、影響吸附柱色譜分離效果的因素第二節(jié)柱色譜的方法返回11吸附劑的種類和性質(zhì)

吸附劑的一般要求：較大的表面積與一定的吸附能力。不與展開劑其化學(xué)變化，不與待分離的物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)或催化、分解或締合，顆粒均勻。極性強(qiáng)弱的判斷(與功能基的種類、數(shù)目多少和排列方式有關(guān))：親水性基團(tuán)與極性成正比，親脂性基團(tuán)與極性成反比；游離型化合物極性弱、具親脂性，解離型化合物極性強(qiáng)、具親水性；溶劑的極性—依據(jù)介電常數(shù)來決定。

吸附劑的種類和性質(zhì)吸附劑的一般要求：12吸附劑的種類和性質(zhì)

（1）極性吸附劑硅膠，氧化鋁均為極性吸附劑，特點(diǎn)為：a)對極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力，極性強(qiáng)的溶質(zhì)將被優(yōu)先吸附。

b)溶劑極性較弱，則吸附劑對溶質(zhì)將表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力。溶劑極性增強(qiáng)，則吸附劑對溶質(zhì)的吸附能力隨之減弱。

c)溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強(qiáng)的溶劑時(shí)，又可被后者置換洗脫下來。吸附劑的種類和性質(zhì)（1）極性吸附劑13吸附劑的性質(zhì)極性和非極性吸附劑活化硅醇基酸性吸附劑硅膠吸附劑的性質(zhì)極性和活化硅醇基酸性吸附劑硅膠14吸附劑的性質(zhì)氧化鋁極性吸附劑堿性Na2CO3中性酸性稀HCl；稀HNO3吸附劑的性質(zhì)氧化鋁堿性中性酸性15吸附劑的種類和性質(zhì)

（2）聚酰胺不溶于水和有機(jī)溶劑，以氫鍵吸附（酰氨基與酸類、酚類等），半化學(xué)吸附。聚酰胺分子中有許多酰胺基，聚酰胺上的C=O與酚基，黃酮類、酸類中的-OH或-COOH形成氫鍵。酰胺基中的氨基與醌類或硝基類化合物中的醌基或硝基形成氫鍵。由于被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，或同一類結(jié)構(gòu)化合物中的活性基團(tuán)的數(shù)目及位置的不同而是之于聚酰胺形成氫鍵的能力不同而得到分離。吸附劑的種類和性質(zhì)（2）聚酰胺16吸附劑的性質(zhì)分離酚類、醌類、黃酮類化合物分離極性和非極性物質(zhì)酰氨基氫鍵吸附聚酰胺吸附劑的性質(zhì)分離分離酰氨基氫鍵吸附聚酰胺17吸附劑的種類和性質(zhì)

（3）活性炭活性炭為非極性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反，對非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力，在水中對溶質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)的吸附能力。溶劑極性降低，則活性炭對溶質(zhì)的吸附能力也隨之降低。吸附劑的吸附力一定時(shí)，溶質(zhì)極性越強(qiáng)，洗脫劑的極性越弱。吸附劑的種類和性質(zhì)（3）活性炭18吸附劑的性質(zhì)活性碳非極性吸附劑極性基團(tuán)多>極性基團(tuán)少芳香族>脂肪族大分子量>小分子量返回吸附劑的性質(zhì)活性碳極性基團(tuán)多芳香族大分子量返回19根據(jù)介電常數(shù)作判斷介電常數(shù)高，洗脫能力大。如何選擇溶劑？與被分離物質(zhì)的極性有關(guān)與所選用的吸附劑性質(zhì)有關(guān)化合物的極性強(qiáng)弱由其存在狀態(tài)（游離型或解離型）所決定，并受溶劑pH值的影響。對于極性吸附劑，溶劑的介電常數(shù)越大，極性也越大，洗脫能力就越強(qiáng)；對于非極性吸附劑，情況正相反。返回根據(jù)介電常數(shù)作判斷介電常數(shù)高，洗脫能力大。如何選擇溶劑？與被20中等極性的吸附劑弱極性的洗脫劑極性較強(qiáng)的洗脫劑中等極性的洗脫劑極性較強(qiáng)的吸附劑極性較弱的吸附劑被分離物質(zhì)中等極性的物質(zhì)極性較強(qiáng)的物質(zhì)極性很小且不含氧的物質(zhì)/含氧的非極性物質(zhì)＋＋＋返回中等極性的吸附劑弱極性的洗脫劑極性較強(qiáng)的洗脫劑中等極性的洗脫21色譜柱的選擇返回大孔樹脂柱色譜柱的選擇返回大孔樹脂柱22分配色譜二、分配色譜1、原理：由各待測物在互不相溶的兩溶液中的分配系數(shù)不同而得到分離的方法。2、流動(dòng)相：為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液極性應(yīng)相差越大越好。1）正相分配柱色譜：以水或親水性溶劑為固定相，與水不相混溶的有機(jī)溶劑作移動(dòng)液相的分配色譜。流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離。2）反相分配柱色譜：以親脂性有機(jī)溶劑作固定相，以水或親水性溶劑作移動(dòng)相的分配色譜。流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離。分配色譜二、分配色譜233、分配柱色譜分離條件的選擇1）支持劑的選擇：溶劑、被分離物質(zhì)、固定相液體。2）固定相的選擇：分離親水性成分/親脂性成分。3）洗脫劑的選擇：先用相應(yīng)的薄層色譜結(jié)果選定，正相/反相分配色譜。4、分配柱色譜的操作技術(shù)裝柱；加樣；洗脫。5、分配柱色譜的應(yīng)用分配色譜3、分配柱色譜分離條件的選擇分配色譜24現(xiàn)要分離一含A和B的樣品，A的極性小于B，固定相為Permaphase-ETH（即硅膠－脂肪醚基聚合鍵合相），而流動(dòng)相有兩種可供選擇（1）甲醇－水（35：100）（2）二氧雜環(huán)己烷－己烷（1：99）。其他操作條件類似。試問下列情況下，應(yīng)選什么作流動(dòng)相，出峰順序如何？為什么？1、大量A中含有微量B；2、大量B中含有微量A。分配色譜現(xiàn)要分離一含A和B的樣品，A的極性小于B，固定相為Perma25正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系分配色譜正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極26三、離子交換色譜此法適于如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、生物堿、有機(jī)酸及酚類化合物等的分離。1.原理：利用待測離子對固定相的親和（或離子交換）能力的差別來實(shí)現(xiàn)分離。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：離子交換色譜三、離子交換色譜離子交換色譜272.固定相1）按離子交換劑類型分四種：離子交換色譜2.固定相離子交換色譜282）按結(jié)構(gòu)分：a）多孔型；b）表面多孔型；c）離子交換鍵合相

微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆離子交換色譜2）按結(jié)構(gòu)分：a）多孔型；b）表面多孔型；c）離子交換鍵29

3.流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)度)，通過改變pH、緩沖劑類型、離子強(qiáng)度、加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來控制分配比k。思考：采用離子交換色譜分離酚類樣品時(shí)，流動(dòng)相pH從比它的pKa小一個(gè)單位，改變到大一個(gè)單位時(shí)，該酚的保留值變化情況是什么？為什么？思考：離子交換色譜法中，流動(dòng)相常以無機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相。請問緩沖液的pH值及離子強(qiáng)度對分離各有何影響？離子交換色譜3.流動(dòng)相離子交換色譜305、離子色譜(IC)和離子對色譜法（IPC）1）離子色譜由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高2個(gè)數(shù)量級，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會完全掩蓋待測離子信號。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)，從而用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量。該法的缺點(diǎn)為：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)抑制柱后會展寬，降低分離度。離子色譜5、離子色譜(IC)和離子對色譜法（IPC）離子色譜31離子色譜離子色譜32抑制器的作用離子色譜思考：IC分離中，何為抑制柱？分析陰離子時(shí)，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹脂？抑制器的作用離子色譜思考：IC分離中，何為抑制柱？分析陰離子33離子色譜電化學(xué)抑制器的工作原理((陰離子)離子色譜電化學(xué)抑制器的工作原理((陰離子)34抑制器的主要作用：安裝在電導(dǎo)池之前；提高待測離子的電導(dǎo)率：提高靈敏度；Na+,Cl-→H+,Cl-降低背景電導(dǎo)(淋洗液):減少噪音。Na+,HCO3-→

H2CO3Na+,OH-

→H2O離子色譜抑制器的主要作用：離子色譜352）離子交換色譜柱的應(yīng)用（1）無機(jī)的陰陽離子陰離子：F，Cl，NO3,SO4；陽離子：Li，Na,K,NH4等（2）小分子的極性化合物：有機(jī)酸：甲酸，乙酸，丙酸，檸檬酸，草酸等有機(jī)胺：甲胺，乙胺，乙醇胺，三甲胺等（3）在強(qiáng)堿性溶液中成離子狀態(tài)（a）糖、糖醇、醇：pKa在12-14之間的弱酸，在10-200mmol的NaOH溶液中全部離子形式存在（b）氨基酸：兩性離子，在強(qiáng)堿介質(zhì)中可以形成離子離子交換色譜2）離子交換色譜柱的應(yīng)用離子交換色譜36離子交換分離機(jī)理離子交換色譜離子交換分離機(jī)理離子交換色譜37價(jià)態(tài)的影響離子交換色譜價(jià)態(tài)的影響離子交換色譜38離子半徑的影響離子交換色譜離子半徑的影響離子交換色譜39極化程度的影響離子交換色譜極化程度的影響離子交換色譜40分離陰離子離子交換色譜分離陰離子離子交換色譜41分離陽離子離子交換色譜分離陽離子離子交換色譜423）離子排斥色譜法的分離機(jī)理：1.Donnan排斥作用－Donnan膜的負(fù)電荷層排斥完全離解的離子型化合物，僅允許未離解的化合物通過2.吸附－保留時(shí)間有機(jī)酸的烷基鍵的長度有關(guān)。通常烷基鍵越長，其保留時(shí)間也越長。3.空間排阻－與有機(jī)酸的分子量大小及交換樹脂的交聯(lián)度有關(guān)離子色譜3）離子排斥色譜法的分離機(jī)理：離子色譜43離子排斥法分離機(jī)理離子色譜離子排斥法分離機(jī)理離子色譜44離子排斥法分離有機(jī)酸離子色譜離子排斥法分離有機(jī)酸離子色譜454）離子對色譜法離子對色譜主要用來分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。將與待測物離子A電荷相反的離子B（稱為對離子或反離子）加入到流動(dòng)相（常為有機(jī)相）中，使待測離子A與離子B形成離子對AB，該AB離子對的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離子的保留特性。思考：有一強(qiáng)極性有機(jī)酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流動(dòng)相中應(yīng)加入陰離子還是陽離子來開成離子對？離子對色譜4）離子對色譜法離子對色譜46反相離子對（流動(dòng)相離子色譜）分離機(jī)理離子對色譜反相離子對（流動(dòng)相離子色譜）分離機(jī)理離子對色譜47反相離子對的分離機(jī)理：1.生成離子對－待測離子與離子對試劑生成中性““離子對”分布于固定相與流動(dòng)相之間，其分離類似傳統(tǒng)的反相分離2.動(dòng)態(tài)離子交換－離子對試劑的疏水部分吸附于固定相形成動(dòng)態(tài)的離子交換表面，其分離機(jī)理類似于離子交換。3.離子間相互作用－除包括以上兩種分離機(jī)理和固定相表面雙電層結(jié)構(gòu)的分離機(jī)理。離子對色譜反相離子對的分離機(jī)理：離子對色譜48凝膠柱色譜四、凝膠柱色譜法尺寸排阻色譜1.分離原理：凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被洗出來，小分子則完全滲透。凝膠柱色譜四、凝膠柱色譜法49凝膠柱色譜2．載體在水中不溶、但可膨脹的球型顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。3．凝膠色譜分類凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。凝膠柱色譜2．載體504.凝膠色譜柱操作技術(shù)1）固定相和流動(dòng)相的選擇2）操作技術(shù)5、凝膠色譜柱的應(yīng)用分離肽的混合物（P99圖4－14）思考題：凝膠色譜法和其他色譜法一樣，組分的分配系數(shù)越大，在柱內(nèi)停留的時(shí)間越長，所得的色譜峰的寬度也就越大。對嗎？為什么？凝膠柱色譜4.凝膠色譜柱操作技術(shù)凝膠柱色譜51五、親合色譜1、分離原理：于載體表面先鍵合具有一般反應(yīng)性能的環(huán)氧或聯(lián)氨（稱為間隔臂），然后再連接上配基，如酶、抗原或激素。生物大分子與固定相之間的特異親合力進(jìn)行選擇性分離及純化的方法