項目四發(fā)酵滅菌項目四學習目標知識目標1.知道發(fā)酵行業(yè)常用滅菌的原理和方法。2.知道無菌空氣的質(zhì)量要求。3.能陳述培養(yǎng)基滅菌的常用方法。4.能陳述影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素。5.能陳述空氣的除菌原理、流程和常用的方法；技能目標1.能夠按照培養(yǎng)基滅菌工藝，進行操作和控制。2.能根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，選擇合理的空氣凈化設(shè)備。3.能認識發(fā)酵罐中主要部件，清楚它們的作用，進行實罐滅菌。學習目標知識目標請大家思考：假如你是某單位化驗室的檢驗員，進行微生物檢驗時，不知什么原因培養(yǎng)基已受到污染，你并不知道，繼續(xù)進行檢驗操作時，結(jié)果將如何？有哪些原因?qū)е挛廴?？如何避免?/p>

請大家思考：假如你是某單位化驗室的檢驗員，進行微生物檢驗時，在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進行滅菌操作？1、由于雜菌的污染，使生物反應(yīng)中的基質(zhì)或產(chǎn)物因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降；2、由于雜菌所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，或在染菌后改變了培養(yǎng)液的某些理化性質(zhì)，使產(chǎn)物的提取和分離變得困難，造成收率降低或使產(chǎn)品的質(zhì)量下降；3、雜菌會大量繁殖，會改變反應(yīng)介質(zhì)的PH值，從而使生物反應(yīng)發(fā)生異常變化；4、雜菌可能會分解產(chǎn)物，從而使生產(chǎn)過程失??；5、發(fā)生噬菌體污染，微生物細胞被裂解，而使生產(chǎn)失敗.為防止雜菌的污染，哪些需要滅菌？培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣、菌種制作在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進行滅菌操作？1、由于雜菌的污染，使生背景資料（一）概念:滅菌、消毒、除菌、防腐滅菌:用化學或物理方法殺死物料或設(shè)備中所有微生物的過程。包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子。消毒:用物理或化學方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌芽孢。除菌:

用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。防腐:

用物理或化學方法抑制微生物的生長和繁殖。（低溫、高滲、缺氧、高酸度、干燥、防腐劑）背景資料（一）概念:滅菌、消毒、除菌、防腐（二）滅菌方法1、化學試劑滅菌法適用范圍：環(huán)境空氣、皮膚及器械的表面消毒2、射線滅菌法適用范圍：無菌室、接種箱

3、干熱滅菌法適用范圍：金屬或玻璃器皿4、濕熱滅菌法適用范圍：廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌5、過濾除菌法利用過濾方法阻留微生物適用范圍：制備無菌空氣（二）滅菌方法1、化學試劑滅菌法（三）濕熱滅菌原理熱阻（耐熱性）熱死時間：即在規(guī)定溫度下殺死一定比例的微生物所需要的時間。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時間：在此溫度下，殺死全部微生物所需要的時間。熱阻：對熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻：指微生物在某一特定條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。（三）濕熱滅菌原理熱阻（耐熱性）2.微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬間殘留的活菌數(shù)N成正比，即

滅菌時間取決于培養(yǎng)基中所含的原始微生物數(shù)（No），滅菌的程度（Nt）和k值。當Nt=0時，t=∞，

既無意義，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次滅菌中只有一次失敗。

2.微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律在一定溫度下，微生物受熱致比熱死速率常數(shù)k

k↓，熱阻↑,t↑

滅菌速度常數(shù)K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的，K值愈小，則此微生物愈耐熱。10t(min)N/N0嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-451015202512111611010810510t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-424681060585654比熱死速率常數(shù)kk↓，熱阻↑,t↑10t(m（四）發(fā)酵設(shè)備簡介

發(fā)酵罐指工業(yè)上用于培養(yǎng)微生物或細胞的封閉容器或生物反應(yīng)裝置。機械攪拌通風發(fā)酵罐主要有罐體、攪拌器、擋板、軸封、空氣分布器、傳動裝置、冷卻管、消泡器、人孔、視鏡等。（四）發(fā)酵設(shè)備簡介發(fā)酵罐指工業(yè)上用于培養(yǎng)微生物或細胞的封閉任務(wù)一培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌一、滅菌溫度和時間的選擇

（1）滅菌溫度：速率常數(shù)與T有關(guān)，這可用阿累尼烏斯方程來表示：

K＝A*e－E/RTA：比例常數(shù)；E：殺死微生物所需的活化能；R：氣體常數(shù)A、E值視菌種而異，A＝1.34—1.36，一般殺死微生物的營養(yǎng)體的E＝200-270kj/mol，芽孢E＝400kj/mol，R＝1.987卡/K﹒mol。K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。K值越小，說明微生物的熱阻越大。任務(wù)一培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌一、滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度和時間的選擇（2）對營養(yǎng)成分由于大部分培養(yǎng)基受熱的破壞為一級分解反應(yīng)：dC/dt＝－KC（3）反應(yīng)物濃度同樣K'＝A'.e－E/RT當溫度從T1升至T2，滅菌速度常數(shù)K和培養(yǎng)基成分破壞的速度常數(shù)K'的變化情況：K1＝A'.e－E/RT1K2＝A'.e－E/RT2滅菌溫度和時間的選擇（2）對營養(yǎng)成分滅菌溫度和時間的選擇（lnk2/k1）/（lnk‘2/k’1）=E/E‘由于滅菌時間的活化能E>培養(yǎng)基成分破壞的活化能E'，所以：lnK2/K1>lnK'2/K'1，即隨T升高，滅菌速率常數(shù)的增加倍數(shù)>培養(yǎng)基成分破壞的速率常數(shù)的倍加倍數(shù)。結(jié)論：在熱滅菌過程中，同時產(chǎn)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞兩個過，溫度升高，兩分過程的速率都升高，但其中微生物死亡速率隨T升高更為顯著。因此，我們在滅菌時選擇較高溫度，較短時間，以減少培養(yǎng)基的破壞，這就是通常所說的“高溫瞬時滅菌法”。滅菌溫度和時間的選擇（lnk2/k1）/（lnk‘2/k’1滅菌時間的計算例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在1210C溫度下實罐滅菌，原污染程度為每1ml有2×105個耐熱細菌芽孢，已知1210C時滅菌速度常數(shù)k=1.8min-1，求滅菌失敗機率為0.001時所需時間。解：N0=40×106×2×105=8×1012(個)Nt=0.001(個)k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)

由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當培養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個作用較為顯著，故實際保溫階段時間比計算值要短。滅菌時間的計算例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在1210連續(xù)滅菌時間的估算例2．某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為1310C，原污染程度為每1ml含有2×105個雜菌，已知1310C時滅菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時間。解：N0=2×105(個/ml)Nt=0.001/(40×106)=2.5×10-11(個/ml)t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min連續(xù)滅菌時間的估算例2．某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)二.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素培養(yǎng)基成分油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機物等增加微生物的耐熱性低濃度（1%-2%）NaCl對微生物有保護作用，隨著濃度增加，保護作用減弱，當濃度達8%-10%以上，則減弱微生物的耐熱性。二.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素培養(yǎng)基成分4.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素pH：pH6.0-8.0，微生物最耐熱，pH<6.0，H+易滲入微生物細胞內(nèi)，改變細胞的生理反應(yīng)促使其死亡。∴培養(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時間愈短。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)（顆粒大?。┡菽号菽械目諝庑纬筛魺釋?，對滅菌極為不利，可加入少量消泡劑。培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量4.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素pH：pH6.0-8.0，微生三、培養(yǎng)基滅菌工藝（一）培養(yǎng)基的分批滅菌（實罐滅菌）分批滅菌就是指將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起滅菌的操作過程，也稱實罐滅菌或間歇滅菌。過程包括：升溫、保溫和冷卻等三個階段。各階段對滅菌的貢獻：20%、75%、5%24016012080時間（min)050100150溫度升溫冷卻保溫三、培養(yǎng)基滅菌工藝（一）培養(yǎng)基的分批滅菌（實罐滅菌）2401滅菌工藝過程分空氣過濾器滅菌并用空氣吹干夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，空氣管通蒸汽，也可夾套內(nèi)通蒸汽達70℃左右取樣管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保溫保溫階段，凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定罐壓接近空氣壓力保溫結(jié)束，依次關(guān)閉各排汽、進汽閥門夾套或蛇管中通冷水培養(yǎng)基降溫到所需溫度向罐內(nèi)通無菌空氣滅菌工藝過程分空氣過濾器滅菌夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，（二）連續(xù)滅菌（連消）連續(xù)滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐時進行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱為連消。連續(xù)滅菌時，培養(yǎng)基在短時間內(nèi)被加熱到滅菌溫度（一般高于分批滅菌溫度，130～160℃），短時間保溫（一般為5～8min）后，被快速冷卻，再進入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐。（二）連續(xù)滅菌（連消）連續(xù)滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵連消塔維持罐冷卻管噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵連連續(xù)滅菌流程連續(xù)滅菌流程分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（1）殺菌鍋內(nèi)滅菌固體培養(yǎng)基滅菌（2）種子罐、發(fā)酵罐、計量罐、補料罐等的空罐滅菌及管道滅菌（3）空氣總過濾器和分過濾器滅菌（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（1）殺菌鍋內(nèi)滅菌固體培（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（4）種子培養(yǎng)基實罐滅菌（5）發(fā)酵培養(yǎng)基實罐實菌（6）發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌（7）消泡劑滅菌（8）補料實罐滅菌（9）尿素溶液滅菌（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（4）種子培養(yǎng)基實罐滅菌任務(wù)二空氣凈化（一）空氣中微生物的分布空氣(即大氣)是一種氣態(tài)物質(zhì)的混合物，此外，尚有懸浮在空氣中的灰塵，主要由構(gòu)成地殼的無機物質(zhì)微粒、煙灰、植物的花粉以及種類繁多的細菌和其他微生物所組成。

空氣中常見的微生物種類及其大小

任務(wù)二空氣凈化（一）空氣中微生物的分布

（二）發(fā)酵用無菌空氣的質(zhì)量標準

發(fā)酵用的無菌空氣，達到以下標準：

①連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。②空氣的壓強（表壓）為0.2～0.4MPa。③進入過濾器之前，空氣的相對濕度φ≤70%。④進入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高10～30℃。⑤壓縮空氣的潔凈度，在設(shè)計空氣過濾器時，一般取失敗概率10-3為指標。也可以把100級作為無菌空氣的潔凈指標。（二）發(fā)酵用無菌空氣的質(zhì)量標準發(fā)酵用的無菌空氣，達（三）空氣除菌方法輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、β射線、γ射線、紫外線(2265?~3287?)加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機產(chǎn)生的熱量靜電除菌：常用于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。過濾除菌：采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質(zhì)有棉花、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維、有機和無機燒結(jié)材料等等。（三）空氣除菌方法輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、β（四）空氣過濾除菌的原理與介質(zhì)1.過濾除菌的種類絕對過濾：過濾介質(zhì)的濾孔小于細胞和孢子。如聚乙烯醇縮甲醛樹脂（PVF）制成的0.3m的微孔濾膜。深層介質(zhì)過濾：介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細胞。如用棉花、玻璃纖維和顆?；钚蕴刻畛涞倪^濾器。（四）空氣過濾除菌的原理與介質(zhì)1.過濾除菌的種類2.深層介質(zhì)過濾的原理

微粒隨氣流通過濾層時，由于濾層纖維的層層阻礙，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運動速度和方向的繞流運動，引起微粒與濾層纖維間產(chǎn)生慣性沖擊、攔截、布朗擴散、重力沉降、靜電引力等作用把微粒滯留在纖維表面上，實現(xiàn)過濾的目的。2.深層介質(zhì)過濾的原理微粒隨氣流通過濾層時，由于濾層3.空氣過濾除菌介質(zhì)（１）纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)棉花：常用，有彈性，纖維長度適中。玻璃纖維：直徑小，不易折斷，過濾效果好?；钚蕴浚阂筚|(zhì)地堅硬，顆粒均勻。

缺點：體積大，裝填費時費力，松緊度不易掌握，空氣壓降大。（２）紙類過濾介質(zhì)——超細玻璃纖維紙

3~6張疊在一起使用，過濾效率高，壓降小。缺點：強度不大（特別是受潮后）。3.空氣過濾除菌介質(zhì)（１）纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程空氣空壓機貯氣罐冷卻除油水加熱空氣預(yù)處理總過濾器分過濾器無菌空氣

空氣過濾發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程空氣空壓機貯氣罐（五）空氣的預(yù)處理1.原理：除塵(外源空氣的前處理)：防塞，提高過濾效率和濾器壽命；措施：建吸風塔、粗過濾器（布袋過濾器、填料過濾器、油浴洗滌和水霧除塵裝置等）、高效前置過濾器降溫：防燒傷介質(zhì)及水分蒸發(fā)嚴重，對發(fā)酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過濾器長菌堵塞（因水滴）