一、生物大分子的分離與純化技術(shù)

二、肝酶提取一、生物大分子的分離與純化技術(shù)

二、肝酶提取1引言在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問(wèn)題，有能夠達(dá)到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無(wú)從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工作。引言在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，2什么是生物大分子？

生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)具有一定的規(guī)律性，由基本結(jié)構(gòu)單位按一定順序和方式連接而形成的多聚體稱為生物大分子。其分子量一般大于10000。有：蛋白質(zhì)(包括酶)、多聚糖和核酸類化合物等。什么是生物大分子？生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)具有一定的規(guī)律性3生物大分子分離純化的特殊性⑴生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長(zhǎng)。⑶許多生物大分子一旦離開(kāi)了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過(guò)程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷。生物大分子分離純化的特殊性⑴生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含4設(shè)計(jì)思路前期準(zhǔn)備生物材料的選擇及預(yù)處理組織與細(xì)胞破碎初級(jí)提取分離精細(xì)分離純化純度鑒定產(chǎn)物處理設(shè)計(jì)思路前期準(zhǔn)備生物材料的選擇及預(yù)處理組織與細(xì)胞破碎初級(jí)提取5前期準(zhǔn)備一、明確目的和要求二、了解的生物大分子的物學(xué)性質(zhì)

1)在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。

2)在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性

3)固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。

4)各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場(chǎng)中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹(shù)脂等填料中的分配系數(shù)

5)其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。

6)對(duì)其他生物分子的特殊親和力。前期準(zhǔn)備一、明確目的和要求6生物材料選擇

制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?。材料的?lái)源無(wú)非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。選擇的材料應(yīng)含量高、來(lái)源豐富、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。

動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?，如果所要求的成分在?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。

植物要先去殼、除脂。

微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保存。動(dòng)物材料則需深度冷凍保存。生物材料選擇制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳?組織細(xì)胞的破碎

不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門(mén)的細(xì)胞破碎方法。(1)機(jī)械法：1)研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2)組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎。組織細(xì)胞的破碎8(2)物理法：1)反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些。3)壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高壓下使細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4)冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。(2)物理法：9(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：1)自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。2)溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。

3)酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。4)有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：10“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過(guò)預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過(guò)程。影響提取的因素主要有：目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??；由固相擴(kuò)散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時(shí)間等。通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。生物大分子的提取“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過(guò)預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶11⑴水溶液提取：蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。

⑵有機(jī)溶劑提取：一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。

⑴水溶液提?。旱鞍踪|(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和12分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許多雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化。分離提純各種生物大分子，主要根據(jù)各種物質(zhì)的分子大小、溶解度、帶電性、親和力大小等差異，選用有機(jī)溶劑沉淀，等電點(diǎn)沉淀，鹽析，層析，電泳，超離心，吸附，結(jié)晶等方法分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許多雜質(zhì)，13分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許多雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化。分離提純各種生物大分子，主要根據(jù)各種物質(zhì)的分子大小、溶解度、帶電性、親和力大小等差異，選用有機(jī)溶劑沉淀，等電點(diǎn)沉淀，鹽析，層析，電泳，超離心，吸附，結(jié)晶等方法。離子交換層析法電泳法電荷性質(zhì)的差異分子大小形狀差異凝膠過(guò)濾法超濾法透析法離心法溶解度差異分配層析萃取結(jié)晶鹽析有機(jī)溶劑沉淀

選擇性沉淀沉淀法分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許14產(chǎn)品處理濃縮、干燥經(jīng)過(guò)分離、純化得到的提取液有時(shí)很稀，體積較大，需要采用蒸餾法、冰凍法、吸收法、超濾法等，去除水分而濃縮、干燥。保存保存應(yīng)在低溫避光環(huán)境下，有時(shí)還需加入防腐劑或穩(wěn)定劑，防止生物大分子變性失活。產(chǎn)品處理濃縮、干燥15肝酶分離純化與鑒定

設(shè)計(jì)從動(dòng)物肝組織中分離、提取、純化、和鑒定一種酶（該酶由不同的亞基組成，為結(jié)合酶，pI=6.2）的技術(shù)路線，并說(shuō)明試驗(yàn)各步驟的原理肝酶分離純化與鑒定設(shè)計(jì)從動(dòng)物肝組織中分離、提16相關(guān)問(wèn)題亞基：組成蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)最小的共價(jià)單位，是指四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的球蛋白結(jié)合酶：分蛋白質(zhì)部分：酶蛋白(apoenzyme)和輔助因子(cofactor)，輔助因子中含金屬離子、小分子化合物PI：等電點(diǎn)：在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽(yáng)離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。

相關(guān)問(wèn)題亞基：組成蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)最小的共價(jià)單位，是指四級(jí)結(jié)構(gòu)17取動(dòng)物肝臟組織制作組織漿液所需蛋白的粗提蛋白的純化活性的檢驗(yàn)?zāi)z電泳鑒定提取純度實(shí)驗(yàn)主要流程取動(dòng)物肝臟組織制作組織漿液所需蛋白的粗提蛋白的純化活性的檢驗(yàn)18取動(dòng)物肝臟組織材料選擇。選取新鮮的，饑餓24小時(shí)的動(dòng)物的肝臟，生理鹽水多次洗滌，低溫保存。取動(dòng)物肝臟組織材料選擇。選取新鮮的，饑餓24小時(shí)的動(dòng)物的肝臟19制作組織漿液取新鮮動(dòng)物肝臟剪碎冰放進(jìn)培養(yǎng)皿中移入勻漿器過(guò)濾勻漿液為減低研磨或勻漿過(guò)程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷制作組織漿液取新鮮動(dòng)物肝臟剪碎冰放進(jìn)培養(yǎng)皿中移入勻漿器過(guò)濾勻20蛋白質(zhì)的粗提原

理

中性鹽類能破壞溶液中蛋白分子表面的雙電層和水膜，從而使蛋白質(zhì)從溶液中凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白質(zhì)所需鹽類的濃度不同。例如，50％飽和的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33％飽和的硫酸銨則使γ-球蛋白沉淀。）因此，可根據(jù)所要分離的蛋白質(zhì)，選擇不同飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析。蛋白質(zhì)的粗提原

理21加磷酸緩沖溶液、再加硫酸銨飽和溶液。要在攪拌下緩慢勻少量多次地加入盡量避免局部硫酸銨濃度過(guò)大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離。勻漿液+藥品混勻轉(zhuǎn)移離心粗蛋白加磷酸緩沖溶液、再加硫酸銨飽和溶液。要在攪拌下緩慢勻22

等電點(diǎn)沉淀技術(shù)許多蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)（pI）處凈電荷為零，溶解度最低，可以沉淀出來(lái)。故選用適當(dāng)?shù)木彌_液，調(diào)節(jié)pH，可將目的物以沉淀狀態(tài)分離，再重新溶于適當(dāng)?shù)木彌_液，以供進(jìn)一步純可嘗試調(diào)配pi=6.2，沉淀所需蛋白。

等電點(diǎn)沉淀技術(shù)23蛋白的純化

層析：離子交換層析：定相是具有固定電荷的離子交換劑，動(dòng)相是具有不同PH值和離子強(qiáng)度的溶液凝膠層析：又稱凝膠過(guò)濾、分子篩層析、凝膠滲透層析等。主要是根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同大小分子的排阻效應(yīng)不同而進(jìn)行分離的。吸附層析：主要根據(jù)物質(zhì)對(duì)活性固體表面吸附親和力的差異來(lái)分離。分配層析：是根據(jù)素質(zhì)在定相中溶解度的差異或在定相和動(dòng)相中溶解度的差異來(lái)進(jìn)行分離的親和層析：是根據(jù)生物大分子的生物特異性吸附來(lái)進(jìn)行分離的