一、生物大分子的分離與純化技術(shù)

二、肝酶提取一、生物大分子的分離與純化技術(shù)

二、肝酶提取1引言在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工作。引言在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，2什么是生物大分子？

生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)具有一定的規(guī)律性，由基本結(jié)構(gòu)單位按一定順序和方式連接而形成的多聚體稱為生物大分子。其分子量一般大于10000。有：蛋白質(zhì)(包括酶)、多聚糖和核酸類化合物等。什么是生物大分子？生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)具有一定的規(guī)律性3生物大分子分離純化的特殊性⑴生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計和判斷。生物大分子分離純化的特殊性⑴生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含4設(shè)計思路前期準(zhǔn)備生物材料的選擇及預(yù)處理組織與細(xì)胞破碎初級提取分離精細(xì)分離純化純度鑒定產(chǎn)物處理設(shè)計思路前期準(zhǔn)備生物材料的選擇及預(yù)處理組織與細(xì)胞破碎初級提取5前期準(zhǔn)備一、明確目的和要求二、了解的生物大分子的物學(xué)性質(zhì)

1)在水和各種有機溶劑中的溶解性。

2)在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性

3)固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性。

4)各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)

5)其他化學(xué)性質(zhì)：如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。

6)對其他生物分子的特殊親和力。前期準(zhǔn)備一、明確目的和要求6生物材料選擇

制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?。材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。選擇的材料應(yīng)含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。

動物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?，如果所要求的成分在?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。

植物要先去殼、除脂。

微生物材料要及時將菌體與發(fā)酵液分開。生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保存。動物材料則需深度冷凍保存。生物材料選擇制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳?組織細(xì)胞的破碎

不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。(1)機械法：1)研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2)組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎。組織細(xì)胞的破碎8(2)物理法：1)反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時，時間要長一些。3)壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高壓下使細(xì)胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4)冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。(2)物理法：9(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：1)自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。2)溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。

3)酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。4)有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：10“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。影響提取的因素主要有：目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大小；由固相擴散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時間等。通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大；遠(yuǎn)離等電點的pH值，溶解度增加。提取時所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。生物大分子的提取“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶11⑴水溶液提取：蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。

⑵有機溶劑提取：一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。

⑴水溶液提取：蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和12分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許多雜質(zhì)，必須進一步分離純化。分離提純各種生物大分子，主要根據(jù)各種物質(zhì)的分子大小、溶解度、帶電性、親和力大小等差異，選用有機溶劑沉淀，等電點沉淀，鹽析，層析，電泳，超離心，吸附，結(jié)晶等方法分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許多雜質(zhì)，13分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許多雜質(zhì)，必須進一步分離純化。分離提純各種生物大分子，主要根據(jù)各種物質(zhì)的分子大小、溶解度、帶電性、親和力大小等差異，選用有機溶劑沉淀，等電點沉淀，鹽析，層析，電泳，超離心，吸附，結(jié)晶等方法。離子交換層析法電泳法電荷性質(zhì)的差異分子大小形狀差異凝膠過濾法超濾法透析法離心法溶解度差異分配層析萃取結(jié)晶鹽析有機溶劑沉淀

選擇性沉淀沉淀法分離純化剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許14產(chǎn)品處理濃縮、干燥經(jīng)過分離、純化得到的提取液有時很稀，體積較大，需要采用蒸餾法、冰凍法、吸收法、超濾法等，去除水分而濃縮、干燥。保存保存應(yīng)在低溫避光環(huán)境下，有時還需加入防腐劑或穩(wěn)定劑，防止生物大分子變性失活。產(chǎn)品處理濃縮、干燥15肝酶分離純化與鑒定

設(shè)計從動物肝組織中分離、提取、純化、和鑒定一種酶（該酶由不同的亞基組成，為結(jié)合酶，pI=6.2）的技術(shù)路線，并說明試驗各步驟的原理肝酶分離純化與鑒定設(shè)計從動物肝組織中分離、提16相關(guān)問題亞基：組成蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)最小的共價單位，是指四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中具有三級結(jié)構(gòu)的球蛋白結(jié)合酶：分蛋白質(zhì)部分：酶蛋白(apoenzyme)和輔助因子(cofactor)，輔助因子中含金屬離子、小分子化合物PI：等電點：在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點。

相關(guān)問題亞基：組成蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)最小的共價單位，是指四級結(jié)構(gòu)17取動物肝臟組織制作組織漿液所需蛋白的粗提蛋白的純化活性的檢驗?zāi)z電泳鑒定提取純度實驗主要流程取動物肝臟組織制作組織漿液所需蛋白的粗提蛋白的純化活性的檢驗18取動物肝臟組織材料選擇。選取新鮮的，饑餓24小時的動物的肝臟，生理鹽水多次洗滌，低溫保存。取動物肝臟組織材料選擇。選取新鮮的，饑餓24小時的動物的肝臟19制作組織漿液取新鮮動物肝臟剪碎冰放進培養(yǎng)皿中移入勻漿器過濾勻漿液為減低研磨或勻漿過程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷制作組織漿液取新鮮動物肝臟剪碎冰放進培養(yǎng)皿中移入勻漿器過濾勻20蛋白質(zhì)的粗提原

理

中性鹽類能破壞溶液中蛋白分子表面的雙電層和水膜，從而使蛋白質(zhì)從溶液中凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白質(zhì)所需鹽類的濃度不同。例如，50％飽和的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33％飽和的硫酸銨則使γ-球蛋白沉淀。）因此，可根據(jù)所要分離的蛋白質(zhì)，選擇不同飽和度的硫酸銨溶液進行鹽析。蛋白質(zhì)的粗提原

理21加磷酸緩沖溶液、再加硫酸銨飽和溶液。要在攪拌下緩慢勻少量多次地加入盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離。勻漿液+藥品混勻轉(zhuǎn)移離心粗蛋白加磷酸緩沖溶液、再加硫酸銨飽和溶液。要在攪拌下緩慢勻22

等電點沉淀技術(shù)許多蛋白質(zhì)在其等電點（pI）處凈電荷為零，溶解度最低，可以沉淀出來。故選用適當(dāng)?shù)木彌_液，調(diào)節(jié)pH，可將目的物以沉淀狀態(tài)分離，再重新溶于適當(dāng)?shù)木彌_液，以供進一步純可嘗試調(diào)配pi=6.2，沉淀所需蛋白。

等電點沉淀技術(shù)23蛋白的純化

層析：離子交換層析：定相是具有固定電荷的離子交換劑，動相是具有不同PH值和離子強度的溶液凝膠層析：又稱凝膠過濾、分子篩層析、凝膠滲透層析等。主要是根據(jù)多孔凝膠對不同大小分子的排阻效應(yīng)不同而進行分離的。吸附層析：主要根據(jù)物質(zhì)對活性固體表面吸附親和力的差異來分離。分配層析：是根據(jù)素質(zhì)在定相中溶解度的差異或在定相和動相中溶解度的差異來進行分離的親和層析：是根據(jù)生物大分子的生物特異性吸附來進行分離的