知識(shí)點(diǎn)二蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量1萬(wàn)-

100萬(wàn)之間，其分子直徑1-100nm之間，在膠體顆粒的范圍。蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運(yùn)動(dòng)、光散射、電泳、不能透過(guò)半透膜及具有吸附能力等。一、蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)膠體顆粒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團(tuán)。如：－NH3＋、－COO－、－OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接觸時(shí)，極易吸附水分子，使蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開(kāi)，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。二、蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的兩個(gè)重要因素1·水化膜2.帶有同種電荷蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時(shí)，相同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷，與周?chē)姆措x子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層與雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對(duì)穩(wěn)定的。三、蛋白質(zhì)的凝聚1.凝聚現(xiàn)象即蛋白質(zhì)的水化膜被破壞，分子之間相互合并而沉淀的現(xiàn)象。導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝聚的因素：有機(jī)溶劑，去垢劑，高溫，劇烈晃動(dòng)，高鹽，重金屬。大豆蛋白質(zhì)的凝聚蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周?chē)H水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周?chē)乃訙p弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。2.鹽析沉淀分離常用硫酸銨作分離蛋白質(zhì)的鹽析劑3.醇沉分離法醇沉法：利用雜質(zhì)不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，雜質(zhì)被沉淀出來(lái)的過(guò)程。醇沉法可以沉淀分離淀粉、樹(shù)膠、果膠、粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)、蹂質(zhì)、色素、無(wú)機(jī)鹽等水溶性雜質(zhì)。當(dāng)醇含量在50%一60%時(shí)，可沉淀分離淀粉。當(dāng)含醇量在75%時(shí)，可沉淀蛋白質(zhì)，當(dāng)含醇量達(dá)80%時(shí)，幾乎沉淀分離全部蛋白質(zhì)、多糖、無(wú)機(jī)鹽。四、蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象在電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。蛋白質(zhì)可以?xún)尚噪x解，因而具有電泳特性。蛋白質(zhì)電泳速度和方向與其所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及分子的大小、形狀有關(guān)。電荷多，分子小的泳動(dòng)速度較快；反之則泳動(dòng)較慢。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白分為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。知識(shí)點(diǎn)二蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)一、蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)酚試劑反應(yīng)→

茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)定量、定性測(cè)定常用方法蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，并可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測(cè)定。1.雙縮脲反應(yīng)尿素加熱至180oC左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性條件下能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。注：二肽和氨基酸不能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物紅紫色絡(luò)合物(堿性溶液)Cu2+2、水和茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)、多肽和各種氨基酸以及所有a-氨基酸均能發(fā)生該反應(yīng)，除無(wú)α-氨基的脯氨酸和羥脯氨酸呈黃色反應(yīng)外，其它均生成藍(lán)紫色化合物，最終生成藍(lán)色化合物。第一步是氨基酸被氧化脫氨形成酮酸，酮酸脫羧成醛，放出CO2、NH3，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有藍(lán)色物質(zhì)。第一步還原藍(lán)紫色第二步縮合Folin-酚試劑是由甲、乙兩種試劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀鈉組成，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅色絡(luò)合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成，在堿性條件下，銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物以及蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基（酚基）和色氨酸還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（乙試劑）產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物），其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比?？捎?00nm波長(zhǎng)比色測(cè)定，適于測(cè)定蛋白質(zhì)含量0.05～0.5g/L。3.菲林-酚試劑顯色反應(yīng)含有苯環(huán)的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應(yīng)式如下

4.黃色反應(yīng)多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以呈黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，須加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)?？捡R斯亮藍(lán)G250（R250）具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。5.考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)該反應(yīng)染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時(shí)間達(dá)到平衡，在室溫一小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。在0.01～1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量?？捡R斯亮藍(lán)知識(shí)點(diǎn)三蛋白質(zhì)的紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶共軛雙鍵的酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe和色氨酸Trp。這三種氨基酸在280nm附近有特征性吸收峰。在此波長(zhǎng)范圍，蛋白質(zhì)的A280與其濃度成正比。利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。此外，蛋白質(zhì)的肽鍵在215nm、225nm亦有紫外吸收，可以用于蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。一、蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測(cè)定范圍：0.1～0.5mg/ml1.在波長(zhǎng)280nm和260nm的吸收差法：由于核酸在260nm具有光吸收，對(duì)測(cè)定干擾較大，可采用280nm、260nm同測(cè)法。蛋白質(zhì)濃度mg/ml＝1.45A280-0.74A260假設(shè)1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液的A280為1.0。二、紫外吸收測(cè)定蛋白質(zhì)含量2.280nm光吸收法：根據(jù)蛋白質(zhì)的光吸收值或摩爾消光系數(shù)的文獻(xiàn)值，可以直接查出蛋白質(zhì)的濃度知識(shí)點(diǎn)五蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性

吳憲教授1931年：“天然Pr分子借助次級(jí)鍵連接而成一種緊密，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)，變性作用使次級(jí)鍵破壞從而使結(jié)構(gòu)松散”。一、

蛋白質(zhì)的變性1.定義：

在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)（不包括肽鍵）被破壞，從而引起若干理化性質(zhì)改變和生物學(xué)功能喪失的現(xiàn)象。2023/8/1028變性因素物理因素高溫、高壓紫外線(xiàn)、X射線(xiàn)、電離輻射和超聲波等化學(xué)因素有機(jī)酸、生物堿有機(jī)溶劑、重金屬鹽高濃度尿素、鹽酸胍等2023/8/1029變性實(shí)質(zhì)：破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響。2023/8/1030變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)①生物學(xué)活性喪失②理化性質(zhì)改變③易被蛋白酶水解空間結(jié)構(gòu)改變旋光性、光吸收改變等溶解度↓，沉降率↑粘度↑擴(kuò)散速度↓變性分類(lèi)可逆變性:Pr變性后如將變性劑除去，該P(yáng)r分子的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性還能恢復(fù)，這一過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性。不可逆變性：若變性條件強(qiáng)烈，作用時(shí)間長(zhǎng)，構(gòu)像變化大，理化性質(zhì)難以恢復(fù)。舉例：醫(yī)療；生物制品保存；生活等。應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……2023/8/1032HOCH2CH2SH

ONH2-C-NH2=

NH2+

NH2-C-NH2=UreaGuanidineHClMercaptoethanolCl-SDSSO4-

-(CH2)11CH3常見(jiàn)的蛋白質(zhì)變性劑JuangRH(2004)BCbasics2023/8/1033極性頭部非極性尾巴SDS是一種表面活性劑sodiumdodecylsulfate2023/8/1034SDS在蛋白質(zhì)表面均勻鋪上一層負(fù)電荷SDSboiling變性蛋白質(zhì)成一線(xiàn)狀分子自然狀態(tài)蛋白質(zhì)並且均勻帶上一層負(fù)電荷JuangRH(2004)BCbasics2023/8/1036NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis變性復(fù)性去除變性因素后，變性蛋白恢復(fù)原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，恢復(fù)生物活性的現(xiàn)象。本質(zhì)：一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）

在一定的環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)能夠決定二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。變性蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)雖然遭到破壞，但是一級(jí)結(jié)構(gòu)仍然保持不變，因此除去變性劑后，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，蛋白質(zhì)能卷曲折疊成為能量最低的構(gòu)象，一般天然蛋白質(zhì)正是具有這種能量最低的構(gòu)象。2023/8/1038加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱(chēng)為凝固。因此，凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性。

●蛋白質(zhì)各自所特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是表現(xiàn)其物理性質(zhì)和化學(xué)特性以及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。當(dāng)天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學(xué)因素的影響，使其分子內(nèi)部原有的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致其一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱(chēng)為變性作用。

三、蛋白質(zhì)變性的表征生物活性喪失；物理性質(zhì)（溶解度、粘度、擴(kuò)散系數(shù)、光譜特性等）和化學(xué)性質(zhì)（化學(xué)反應(yīng)，被酶解性）改變應(yīng)用變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……復(fù)性蛋白質(zhì)的變性作用如果不過(guò)于劇烈，則是一種可逆過(guò)程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性蛋白質(zhì)的兩性離解知識(shí)點(diǎn)一蛋白質(zhì)由若干氨基酸組成，雖然絕大多數(shù)氨基與羧基成肽鍵結(jié)合，但是總有一定數(shù)量自由氨基與羧基，以及酚基、巰基、胍基、咪唑基等酸堿基團(tuán)，因此，可以將蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中各種殘基自由分成氨基端和羧基端兩大類(lèi)，氨基端具有結(jié)合質(zhì)子的能力因而具有堿性，羧基端能釋放質(zhì)子因而具有酸性，所以，蛋白質(zhì)具有兩性離解。一、蛋白質(zhì)具有酸堿兩性

pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+常用Pr表示蛋白質(zhì)分子在蛋白質(zhì)溶液中，調(diào)節(jié)溶液的酸堿度達(dá)到一定的氫離子濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷和負(fù)