腸桿菌科細(xì)菌超譜-內(nèi)酰胺酶的研究進(jìn)展

腸球菌是醫(yī)院和社區(qū)感染最常見的病毒。它可能會(huì)導(dǎo)致許多炎癥，如肺炎、尿失禁、呼吸困難、腹膜炎、相關(guān)醫(yī)療感染等。由于幾乎可水解所有頭孢菌素的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)在腸桿菌科細(xì)菌中的流行,對(duì)于重癥感染患者,碳青霉烯類作為最有效的抗菌藥物被廣泛使用。隨著碳青霉烯類藥物消耗量的增加,耐藥菌株開始出現(xiàn),并在全球范圍快速傳播CRE的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)生各種類型碳青霉烯酶、膜孔蛋白缺失或突變聯(lián)合ESBLs或頭孢菌素酶(AmpC)的高水平產(chǎn)生、外排泵的過度表達(dá)等編碼碳青霉烯酶的基因通常存在于可移動(dòng)基因元件上,通過質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子容易在細(xì)菌之間水平傳播,導(dǎo)致局部流行,甚至是感染暴發(fā)1表型篩選試驗(yàn)1.1碳青霉烯菌株對(duì)cpe表達(dá)的敏感性和特異性產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌(carbapenemase-producingEnterobacteriaceaeCPE)通常表現(xiàn)對(duì)一種或多種碳青霉烯類藥物敏感性下降。藥物敏感性檢測(cè)方法主要為最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定及紙片擴(kuò)散法測(cè)量抑菌環(huán)直徑,當(dāng)MIC值升高或抑菌環(huán)直徑縮小提示為可疑的CPE菌株。有報(bào)道指出不同的碳青霉烯藥物對(duì)CPE的篩選能力存在差異,厄他培南敏感性較高,但特異性略差,亞胺培南情況類似,美羅培南在敏感性和特異性的綜合評(píng)價(jià)中有較滿意的結(jié)果判斷CPE的折點(diǎn)目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),Tamma等藥物敏感試驗(yàn)可以方便、快捷地進(jìn)行CPE篩查,同時(shí)可以根據(jù)藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥。但由于其他的耐藥機(jī)制,如膜孔蛋白缺失合并高產(chǎn)AmpC酶同樣可導(dǎo)致碳青霉烯藥物MIC值升高或抑菌環(huán)直徑縮小,有些產(chǎn)酶菌株對(duì)碳青霉烯類藥物水解能力弱,也可出現(xiàn)敏感結(jié)果。因此,產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株藥敏結(jié)果會(huì)出現(xiàn)部分重疊。1.2培養(yǎng)基的改進(jìn)主要有添加了碳青霉烯類藥物的麥康凱培養(yǎng)基及商業(yè)化的顯色培養(yǎng)基,可以直接從臨床標(biāo)本中篩選出耐藥菌株。利用CPE對(duì)碳青霉烯抗生素敏感性下降的特性,以及麥康凱培養(yǎng)基能有效抑制革蘭陽性菌的生長(zhǎng),改進(jìn)后的麥康凱具有很好的選擇作用。在麥康凱培養(yǎng)基中加入1μg/mL亞胺培南用于直腸拭子篩選CPE菌株有很好的檢測(cè)效能ChromIDCARBA是一種新型顯色培養(yǎng)基,專為CPE設(shè)計(jì),添加劑中含有特異性抑制革蘭陽性菌和非產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的成分。Perry等利用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行臨床標(biāo)本中CPE的篩查是一種好方法,最大優(yōu)勢(shì)在于能從多種菌群中分離出目標(biāo)菌,但是孵育過程需24~48h,不能滿足快速檢測(cè)要求,并且不能區(qū)分碳青霉烯酶類型。2表型確認(rèn)試驗(yàn)2.1加酶抑制劑陽性測(cè)定不同類型的碳青霉烯酶活性可被相應(yīng)的抑制劑所抑制,在碳青霉烯類藥物中加入酶抑制劑,可以使藥物的MIC下降或紙片擴(kuò)散法的抑菌環(huán)增大。常用的方法有E-test和紙片增效試驗(yàn),前者判讀標(biāo)準(zhǔn)為加酶抑制劑一側(cè)與另一側(cè)比較MIC值相差8倍以上是陽性,后者可以將抑制劑直接加到藥物紙片中,與原藥物紙片比較抑菌環(huán)的大小,或者將抑制劑紙片貼在藥物紙片附近,觀察兩者是否出現(xiàn)協(xié)同。A類酶抑制劑有硼酸類化合物、克拉維酸等,有文獻(xiàn)評(píng)價(jià)兩種抑制劑對(duì)產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌檢測(cè)能力,硼酸檢出所有產(chǎn)酶株,而克拉維酸靈敏度及特異度稍差抑菌劑增效試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,結(jié)果易于觀察,可區(qū)分碳青霉烯酶類型。但是,當(dāng)以EDTA作為金屬酶抑制劑時(shí),有些菌株本身對(duì)EDTA敏感可出現(xiàn)假陽性,并且檢測(cè)過程需16~20h的孵育,無法快速獲得結(jié)果。2.2改進(jìn)的hough試驗(yàn)mtsHodge試驗(yàn)最早用于淋病奈瑟菌產(chǎn)生青霉素酶的檢測(cè),后來Lee等針對(duì)MHT的不足,研究人員進(jìn)行了多種改進(jìn)。有文獻(xiàn)報(bào)道2.3影響因素較多2012年Nordmann等盡管CarbaNP簡(jiǎn)單快速,但是影響因素較多,如配制試驗(yàn)溶液pH、待測(cè)菌分離選用的培養(yǎng)基、接種量、孵育時(shí)間、結(jié)果判定的主觀因素、黏液型的表型以及酶活性表達(dá)水平等均會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響2.4碳青霉烯酶檢測(cè)CIM2015年由荷蘭vanderZwaluw研究團(tuán)隊(duì)首次提出,可以在8h內(nèi)檢測(cè)革蘭陰性桿菌的碳青霉烯酶,對(duì)KPC、NDM、OXA-48、VIM、IMP和OXA-23型β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)結(jié)果與PCR具有高度一致性CIM試驗(yàn)試劑花費(fèi)少,容易操作,結(jié)果判斷明確,檢測(cè)OXA-48-like靈敏度高2.5輔助激光解吸與傳統(tǒng)離子束檢測(cè)oxa-48-企業(yè)以抗體介導(dǎo)為基礎(chǔ)的免疫層析方法開始應(yīng)用于檢測(cè)碳青霉烯酶,表現(xiàn)了良好的性能,尤其對(duì)于OXA-48-like的檢測(cè)有一定的優(yōu)勢(shì)。攜帶OXA-48-like酶的菌株常表現(xiàn)為對(duì)碳青霉烯類藥物的低MIC值,并且不同于KPC和金屬酶,OXA-48-like缺乏用于表型檢測(cè)所需的特異性抑制劑,在常規(guī)檢驗(yàn)中易造成漏檢。一種商品化的產(chǎn)品OXA-48K-SeT檢測(cè)OXA-48-like的靈敏度和特異度均達(dá)100%基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MAL-DI-TOF/MS)是一種軟電離技術(shù),將樣品分散在基質(zhì)中,在激光照射下分子電離,電離的樣品在電場(chǎng)作用下飛過真空的飛行管,通過離子的質(zhì)量電荷之比與離子的飛行時(shí)間成正比分析離子,測(cè)得樣品分子的分子量達(dá)到鑒定目的。MALDI-TOF/MS通常用于疾病的診斷和藥物代謝研究,近年來在微生物的鑒定方面應(yīng)用較多,對(duì)于耐藥機(jī)制檢測(cè)方面也有很大潛能。Hrabák等3碳青霉烯酶的檢測(cè)方法細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為全球化的問題,特別是CPE引起的感染,由于其高傳播性及高病死率,應(yīng)引起臨床及感控人員的高度重視。準(zhǔn)確、及時(shí)發(fā)現(xiàn)CPE菌株,對(duì)于患者的治療及感控措施的實(shí)施至關(guān)重要。不同的檢測(cè)方法對(duì)不同類型碳青霉烯酶存在檢測(cè)能力上的差異,截至目前,仍缺乏一種完美檢測(cè)手段,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的條件及地區(qū)流行情況進(jìn)行選擇。顯色培養(yǎng)基可以從臨床標(biāo)本中直觀地分離出產(chǎn)酶菌株,在去定植檢測(cè)中有很好的應(yīng)用前景。免疫層析法對(duì)KPC、NDM、OXA-48等常見類型可以在15mi