(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷1免疫細(xì)胞爭(zhēng)論westernblotWesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題及處理總結(jié)阿木1、westernblot的優(yōu)點(diǎn)答：靈敏，可達(dá)ngEcl顯色法理論上可pg級(jí)。便利，特異性高。2:a)你的細(xì)胞中不表達(dá)這種b)你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需參與PMSF，抑制蛋白酶活性；是否有問(wèn)題。3為什么呢？2答：a)SDS濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)，b)也不排解你的抗原濃度過(guò)高，這時(shí)再參與適量上樣緩沖液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小10KDWB？答：可以選擇0.2μml的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷106、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：削減抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，轉(zhuǎn)變一抗孵育時(shí)間，提高牛奶濃度。7、目標(biāo)帶是空白，四周有背景，是為什么？HRP催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反響時(shí)間不長(zhǎng)，將四周底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q底物。8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？答：假設(shè)能夠排解下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半消滅在一抗和抗原制備上。二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c)ECL底物沒(méi)掩蓋到相應(yīng)位置；d) 二抗失活。9、我在顯影液中顯影15分鐘后,底片漆黑一片,是什么緣由呢?答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片原來(lái)就被曝光了，可以在完全黑暗的狀況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。10、DABECM好？答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 敏感的底物；ECM結(jié)果簡(jiǎn)潔把握，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但假設(shè)到達(dá)閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。要看你試驗(yàn)的狀況。11、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大，是怎么回事？答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以翻開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker轉(zhuǎn)上去了，為什么？13、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否確定NaF等？答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大局部時(shí)候是不用加的。14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在，westernblot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？①免疫組化可以用來(lái)進(jìn)展定位，但是不能準(zhǔn)確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背分子，進(jìn)展定量，但是不能定位。②兩種試驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)展什么試驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。〔未加蛋白酶抑制劑點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上樣量已加到120μg，PMSF行嗎？反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。westernblot？5×10^6就足夠了17RNA又提蛋白么？這westernblot有無(wú)影響？答：能，沒(méi)有問(wèn)題。18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)展兩種因子的WesternBlot檢測(cè)嗎？答：固然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。19、假設(shè)目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要留意什么？答：假設(shè)是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫存得多，這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)常常會(huì)覺(jué)察只有一局部蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠覺(jué)察有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么方法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用削減電流延長(zhǎng)時(shí)間，加20％甲醇。200kd的，SDS-電泳的分別膠濃度多大適宜？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白簡(jiǎn)潔作WesternBlot嗎？7％，積層膠3.5％。22、假設(shè)上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以依據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一局部小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。假設(shè)已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可1.5mm的。23、蛋白變性后可以存放多久？答：－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：(也是被酶水解了)。說(shuō)分別膠應(yīng)當(dāng)承受7.5%，但資料卻要求分別膠和濃縮膠均承受11％的配方，不知為何？答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，由于105KD的蛋白在上述兩種膠的線性區(qū)分范圍內(nèi)，但需留意條帶位置。25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知承受這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？似乎有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，由于脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應(yīng)當(dāng)好一點(diǎn)．26、問(wèn)一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？答：WesternBlot30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的開頭摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都要拿到好的結(jié)果，假設(shè)抗體好的話比較簡(jiǎn)潔，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，固然有的不適合WesternBlot的怎樣做也不行。27western的時(shí)候，怎樣處理樣品？答：必需進(jìn)展研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要留意抑制蛋白酶的活性〔參與ＰＭＳＦ。28200KDwestern要留意什么呢？200kdWesternBlot時(shí)要留意，分別膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要留神；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照〔否則消滅雜帶不知道如何分析。(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷1429、有什么方法可以提高上樣量？答：a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增大上樣量；b)5倍的上樣緩沖液來(lái)稀釋變性30、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？則上樣量要均多上就行了，但是不要超載.31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉局部非特異的本底。有何要求？HRP標(biāo)記的二抗。WesternBlot可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原打算簇〔又稱表位而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間構(gòu)造限制，煮后變性會(huì)消逝。假設(shè)你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷25酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于位，則只能用于免疫組化。34、WesternBlot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？2－3后應(yīng)在2－3泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。36、檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。時(shí)，同樣的抗體免疫組WesternBlot卻不能？WesternBlot和免疫組化。396×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，依據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能到達(dá)最正確效果。答：無(wú)特別要求。但我們一般是上槽放穎的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過(guò)一兩次的緩沖液41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液〔30%聚丙酰胺〕有問(wèn)題，你可以重配制一份觀看；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分別小嗎？21kd，濕轉(zhuǎn)120mA45-60min室的閱歷調(diào)整；170kd 90-120min。43轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中參與20%甲醇〔是指終濃度，由于甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合力氣，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使NC膜〔0.2微米〕.8條帶，請(qǐng)問(wèn)什么緣由？怎樣改善？膠用過(guò)marker是買的。答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或削減電泳時(shí)間試試看。固然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。WesternBlot試驗(yàn)半定量確定要加ACTIN內(nèi)參？答：對(duì)于發(fā)表文章的試驗(yàn)最好加內(nèi)參，試驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。46WesternBlot內(nèi)參選擇什么合適？答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。GAPDH哪個(gè)好？beta-actin就可以。48、想問(wèn)一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)分嗎？答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)參與廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特別的方法，一般來(lái)說(shuō)都沒(méi)有區(qū)分。5%TBST脫脂奶粉”TBSTTTween嗎，濃度多大？水800ml溶解,加500-1000ul的Tween-20,HClpH至7.4,加水定容至1L.50、封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒(méi)有什么規(guī)定呢，比方在室溫里做，或者要在4度下?答：均可在室溫進(jìn)展，假設(shè)時(shí)間不夠，一抗4度過(guò)夜。原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，F(xiàn)不易脫落，結(jié)果較好。52、怎樣才能把膠跑的格外秀麗，泳道都能很直，上樣的量和