殺菌劑協(xié)同增效組合防治梨樹主要病害研究

中國是世界梨栽培的三個中心之一。梨種植歷史已有3000多年的歷史，種植面積和產(chǎn)量在世界排名第一，但梨生產(chǎn)技術(shù)相對較低。目前，生產(chǎn)上梨樹病害的防治仍以化學(xué)防治為主（化學(xué)殺菌劑協(xié)同作用的研究旨在挖掘其協(xié)同增效潛力，發(fā)揮其在我國化學(xué)殺菌劑減施增效中的重要作用。當(dāng)前，應(yīng)用化學(xué)殺菌劑防治植物病害時，主要以殺菌劑協(xié)同增效關(guān)鍵技術(shù)以及減量施用為目標(biāo)，為了擴大殺菌劑的殺菌譜并延長其持效期、減少用藥次數(shù)和用藥量、延緩防治對象產(chǎn)生抗藥性，可以將不同作用機制殺菌劑協(xié)同減量使用并發(fā)揮其增效潛力（1材料和方法1.1藥品、試劑及儀器培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar,PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂10g、蒸餾水1L；馬鈴薯葡萄糖瓊脂梨塊（potatodextroseagar+pearlump,PDA+L）培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、鴨梨150g、葡萄糖20g、瓊脂200g、水楊肟酸0.1g、蒸餾水1L,pH6.0～6.2；改良酵母甘油瓊脂（modifiedyeastglycerolagar,MYGA）培養(yǎng)基：酵母浸粉10g、蛋白胨5g、蔗糖10g、NaNO供試病原菌：病葉均采集自河北省泊頭市務(wù)屯子村不同品種梨園。梨黑星病菌Venturianashicola分離自鴨梨病葉，樹齡20年，顯微鏡下挑取單個孢子轉(zhuǎn)接到PDA+L平板于18℃下純化（供試藥劑：90%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽（iminoctadinetrialbesilate）原藥、40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽可濕性粉劑、30%氟菌唑（triflumizole）可濕性粉劑，日本曹達株式會社；99.5%吩嗪α-2羧酸（phenazineα-2carboxylicacid）化合物、95%噻肟菌酯（cefo-trifloxystrobin）原藥、2%吩嗪α-2羧酸可濕性粉劑、20%噻肟菌酯乳油，德國巴斯特（上海）植保有限公司；99.4%辛菌胺醋酸鹽（xinjunanacetate）原藥、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑，陜西省西安嘉科農(nóng)化有限公司；90%氟吡菌酰胺（fluopyram）原藥，拜耳股份公司；98%苯菌酮（metrafenone）原藥、42%苯菌酮懸浮劑、50%醚菌酯（kresoxim-methyl）水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司；90%硝苯菌酯（meptyldinocap）原藥、36%硝苯菌酯乳油，美國陶氏益農(nóng)公司；95%醚菌酯原藥、95%嘧菌酯（azoxystrobin）原藥、95%苯醚甲環(huán)唑（diphenoxazole）原藥，利爾化學(xué)股份有限公司；90%丙硫菌唑（prothioconazole）原藥、10%丙硫菌唑懸浮劑，植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所；95%氟硅唑（fluosilazole）原藥，浙江禾本科技有限公司；95%氟菌唑原藥，江蘇禾本生化有限公司；94%四氟醚唑（tetraconazole）原藥、4%四氟醚唑水乳劑，意大利意賽格公司；41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑，博仕達揚州科技生物有限公司；250g/L嘧菌酯懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑，瑞士先正達作物保護有限公司；400g/L氟硅唑乳油，山東青島瀚生生物科技股份有限公司；1.8%阿維菌素（avermectin）乳油，北京中保綠農(nóng)科技集團有限公司；70%甲基托布津（thiophanate-methyl）可濕性粉劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司；29%石硫合劑（lime-sulfur）水劑，河北雙吉化工有限公司。儀器、試劑及助劑：泰山-18型機動高壓噴霧器，山東華盛農(nóng)業(yè)機械有限責(zé)任公司；35cm×50cm透明米格紙（每格1mm×1mm），上海胡卷印刷廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；VHX-1000三維數(shù)字顯微系統(tǒng)，日本基恩士公司；TDZ5-WS離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；QWJ-150型空壓機帶動喉頭噴霧器，上海曲晨機電技術(shù)有限公司；LRH250A型號全光照培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司公司。99%水楊肟酸，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。助劑包括NF-100、邁道、Tmax、N280，中化集團沈陽化工研究院。1.2方法1.2.1藥物混配組合將供試14種原藥分別用適量丙酮溶解，然后配制成質(zhì)量濃度為1000μg/mL的母液，并按照預(yù)試驗結(jié)果加入無菌水進行系列稀釋。單劑處理包括：90%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽原藥、99.5%吩嗪α-2羧酸化合物和90%丙硫菌唑原藥濃度分別為160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL;99.6%辛菌胺醋酸鹽原藥和90%氟吡菌酰胺原藥濃度分別為640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg/mL;98%苯菌酮原藥、95%噻肟菌酯原藥和94%四氟醚唑原藥濃度分別為160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg/mL;90%硝苯菌酯原藥、95%醚菌酯原藥、95%嘧菌酯原藥和95%氟菌唑原藥濃度分別為640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125μg/mL;95%苯醚甲環(huán)唑原藥和95%氟硅唑原藥濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.0390625μg/mL?；炫浣M合包括：將上述14種原藥兩兩配對得到90個組合，再按體積比10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10對每個組合進行混配。分別將單劑和混配組合藥液與培養(yǎng)基以體積比1∶9配制成終濃度為原配制殺菌劑濃度1/10的含藥平板，其中琥珀酸脫氫酶抑制劑類如氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、苯丙烯氟菌唑、氟唑菌酰羥胺及其混配組合和Qo位點抑制劑類如噻肟菌酯、硝苯菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯及其混配組合用改良MYGA培養(yǎng)基制作含藥平板（采用上述殺菌劑單劑和混配組合處理，將其與培養(yǎng)基按體積比1∶9配制成終濃度為原配制殺菌劑濃度1/10的PDA+L’含藥平板，同時分別以丙酮和清水處理作陰性對照和空白對照。用直徑5mm打孔器在預(yù)培養(yǎng)60d的梨黑星病菌菌落邊緣打取菌餅，正面朝下將菌餅接種到PDA+L’含藥平板中央，每個平板接種1個。每處理重復(fù)4次，置于18℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。同樣采用十字交叉法分別于培養(yǎng)60d后測量各處理的梨黑星病菌菌落直徑，計算各殺菌劑處理的抑制率，并利用DPS軟件計算有效抑制中濃度EC1.2.2離體葉片法測定梨黑星病和梨張量的檢測利用1.2.1篩選到的殺菌劑混配組合進行3種梨樹病害的離體防效測定，以混配組合中所涉及到的殺菌劑單劑為對照，單劑劑量采用常規(guī)推薦用量，混配組合中各組分的劑量不超過單劑劑量，最終篩選出具有增效作用的殺菌劑混配組合。將分離純化好的梨褐斑病菌在PDA平板上培養(yǎng)10d后，用無菌蒸餾水沖洗平板上的孢子，之后以1500r/min離心20min去雜，重復(fù)離心1次，顯微觀察并加水稀釋至孢子懸浮液濃度約為1×10梨黑星病和梨白粉病發(fā)生時先在葉片表面形成薄薄的菌層，用藥后可迅速殺滅菌層，且效果明顯，故采用離體葉片法測定殺菌劑對梨黑星病和梨白粉病的治療效果。各殺菌劑濃度及混配組合同上。將采集的梨黑星病發(fā)病葉片或梨白粉病發(fā)病葉片用濕潤脫脂棉包裹葉柄，置于直徑15cm培養(yǎng)皿的濾紙上，每皿加15mL蒸餾水保濕。藥液噴施方式同上，梨黑星病發(fā)病葉片噴藥后置于18℃全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，梨白粉病發(fā)病葉片置于25℃全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，然后調(diào)查病斑面積并計算離體防效，方法及計算公式同上。1.2.3藥劑、助劑協(xié)同組合用藥試驗在殺菌劑施用時加入助劑或殺蟲劑會對其田間防效和持效期產(chǎn)生影響，而且也可以減少殺菌劑的施用量，本試驗基于1.2.2篩選到的殺菌劑增效組合，在減少20%施用量的基礎(chǔ)上，按照常規(guī)推薦施用量加入助劑或殺蟲劑，再比較2種處理的防效，從而明確助劑或殺蟲劑的增效作用。于2018年5—9月在河北省泊頭市務(wù)屯子村梨園進行田間防效試驗。殺菌劑協(xié)同增效組合及殺菌劑用量設(shè)計同1.2.2。對梨褐斑病田間防效的測定：梨樹品種為新07號，樹齡8年，株行距3m×4m，株高2.0～2.5m，樹勢中等，褐斑病歷年均有發(fā)生，根據(jù)病情發(fā)展和氣候條件用藥，零星發(fā)病時第1次用藥。將上述殺菌劑及組合分別加入殺蟲劑7.2μg/mL阿維菌素、0.1%NF-100、0.1%邁道、0.1%Tmax、0.025%N280，篩選其與殺蟲劑、助劑的增效協(xié)同組合。每處理4次重復(fù)，隨機排列，每小區(qū)4株梨樹。采用泰山-18型機動高壓噴霧器均勻噴施，以葉片、果實濕潤稍有藥滴下淌為止，每株施藥量1.5L，加入助劑或殺蟲劑阿維菌素協(xié)同組合每株施藥量1.2L。用藥時間分別為2018年5月24日、6月11日、6月28日，共噴3次，同時設(shè)置每株噴施1.5L清水為對照。每小區(qū)調(diào)查2株，分東、南、西、北、中方向5點取樣，每株取當(dāng)年生枝條的40片葉，按病斑面積占整個葉片面積的百分率P分級（對梨黑星病田間防效的測定：梨樹品種為鴨梨，樹齡20年，株行距為3m×6m，梨園土壤肥力中等，樹勢及管理水平一致，黑星病歷年均有發(fā)生。每處理4次重復(fù)，隨機排列，每小區(qū)4株梨樹。采用泰山-18型機動高壓噴霧器均勻噴施，至葉片上有藥液流失為止，每株施藥量5L，加入助劑或殺蟲劑阿維菌素協(xié)同組合每株施藥量4L，以每株噴施清水5L為對照。根據(jù)病情發(fā)展和氣候條件確定用藥時間，于梨黑星病零星初現(xiàn)的8月1日用藥1次，噴藥后7、15、30d進行病情調(diào)查，并計算病情指數(shù)和田間防效，調(diào)查方法及計算公式同上。對梨白粉病田間防效的測定：試驗用地與梨褐斑病試驗相同，選用與梨褐斑病試驗用地間隔2m的未用藥地塊進行，梨樹品種及長勢同梨褐斑病選用情況，白粉病歷年均有發(fā)生。梨白粉病初現(xiàn)明顯癥狀后進行第1次用藥，根據(jù)病情發(fā)展和氣候條件用藥。用藥時間分別為2018年7月13日、7月28日、8月8日，共噴3次，施藥量與梨褐斑病相同，同時設(shè)置清水對照。每處理4次重復(fù)，小區(qū)隨機排列，每小區(qū)4株梨樹。施藥方法同梨褐斑病。第3次噴藥后7、15、30d進行病情調(diào)查，并計算病情指數(shù)和防效，調(diào)查方法及計算公式同上。1.2.4農(nóng)民用藥試驗選用的試驗地點、梨樹品種及長勢與1.2.3中梨黑星病田間防治試驗相同，2個處理小區(qū)間隔1m，梨樹主要病害普遍發(fā)生。基于1.2.3試驗結(jié)果制定用藥流程。3月中旬噴施4800μg/mL石硫合劑，4月下旬噴施12μg/mL辛菌胺醋酸鹽，5月上中旬噴施60μg/mL雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+10μg/mL吩嗪α-2羧酸+0.1%Tmax,6月上旬噴施12.5μg/mL丙硫菌唑+12.5μg/mL嘧菌酯，6月中下旬噴施40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.1%NF-100,7月上旬噴施120μg/mL雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+120μg/mL噻肟菌酯，7月中下旬噴施20μg/mL氟吡菌酰胺+20μg/mL嘧菌酯，9月上旬噴施700μg/mL甲基托布津。同期調(diào)查農(nóng)民用藥種類及用藥量，用于比較本試驗制定的用藥流程效果。制定的用藥流程和農(nóng)民用藥流程實施區(qū)域分別為400m試驗數(shù)據(jù)采用DPS6.55軟件進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。2結(jié)果與分析2.1篩選協(xié)同增效組合篩選出兼治梨褐斑病和梨黑星病的協(xié)同增效組合（體積比）共8個：雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+氟菌唑（4∶1）、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+噻肟菌酯（1∶1）、硝苯菌酯+氟硅唑（1∶4）、醚菌酯+氟硅唑（1∶1）、辛菌胺醋酸鹽+噻肟菌酯（1∶5）、苯醚甲環(huán)唑+噻肟菌酯（1∶1）、氟吡菌酰胺+嘧菌酯（1∶1）、丙硫菌唑+嘧菌酯（1∶1），增效系數(shù)分別為2.15、2.87、2.36、3.62、3.46、3.89、4.39、2.87和2.45、2.42、1.77、2.27、2.24、2.85、2.64、2.93（表1），對梨褐斑病和梨黑星病的離體防效分別為99.05%、97.18%、95.16%、93.25%、92.06%、91.17%、90.95%、92.64%和93.82%、92.71%、90.18%、91.44%、90.94%、88.65%、91.95%、92.36%（表2）；篩選出兼治褐斑病和白粉病的協(xié)同增效組合1個：苯菌酮+四氟醚唑（1∶1），對褐斑病的增效系數(shù)為3.21、離體防效為91.38%，對白粉病的離體防效為88.16%；篩選出僅對褐斑病具有協(xié)同增效作用的組合1個：雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+吩嗪α-2羧酸（1∶6），增效系數(shù)為2.64，離體防效為96.44%。2.2協(xié)同增效組合100μg/mL雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+25μg/mL氟菌唑、40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑、15μg/mL苯菌酮+15μg/mL四氟醚唑、8μg/mL辛菌胺醋酸鹽+40μg/mL噻肟菌酯、12.5μg/mL丙硫菌唑+12.5μg/mL嘧菌酯這5個不同殺菌劑協(xié)同增效組合及添加殺蟲劑和助劑且減少20%藥量的4個協(xié)同增效組合12.5μg/mL丙硫菌唑+12.5μg/mL嘧菌酯+7.2μg/mL阿維菌素、100μg/mL雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+25μg/mL氟菌唑+0.1%NF-100、60μg/mL雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+10μg/mL吩嗪α-2羧酸+0.1%Tmax、40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.1%NF-100，第1次用藥后10d對梨褐斑病的田間防效為91.85%～96.96%，第3次用藥后10d對梨褐斑病的田間防效為83.70%～89.96%，第3次用藥后50d對梨褐斑病的田間防效為69.69%～72.20%（表3）。表明加入殺蟲劑阿維菌素或助劑的殺菌劑協(xié)同增效組合對梨褐斑病的田間防效在減少20%藥量時，與未加入阿維菌素、未減量協(xié)同增效組合差異不顯著。2.2.2對梨黑星病的田間防效100μg/mL雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+25μg/mL氟菌唑、10μg/mL硝苯菌酯+40μg/mL氟硅唑、8μg/mL辛菌胺醋酸鹽+40μg/mL噻肟菌酯、20μg/mL苯醚甲環(huán)唑+20μg/mL噻肟菌酯、20μg/mL氟吡菌酰胺+20μg/mL嘧菌酯、12.5μg/mL丙硫菌唑+12.5μg/mL嘧菌酯這6個殺菌劑協(xié)同增效組合及添加助劑且減少20%藥量的4個協(xié)同增效組合40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.1%NF-100、40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.025%N280、40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.1%邁道、40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.1%Tmax，藥后7d對梨黑星病的田間防效為84.56%～97.54%，藥后15d對梨黑星病的田間防效為80.79%～88.77%，藥后30d對梨黑星病的田間防效為75.57%～85.71%（表4），表明加入助劑且減少20%藥量的同時，各殺菌劑協(xié)同增效組合對梨黑星病的田間防效并未降低。2.2.3對梨白酒的田間防效40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑、20μg/mL氟吡菌酰胺+20μg/mL嘧菌酯、12.5μg/mL丙硫菌唑+12.5μg/mL嘧菌酯這3個殺菌劑協(xié)同增效組合及添加助劑且減少20%藥量的1個協(xié)同增效組合40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.1%NF-100，第3次用藥后7d對梨白粉病的田間防效為80.05%～91.82%，第3次用藥后15d的田間防效為80.42%～85.93%，第3次用藥后30d的田間防效為75.27%～79.55%（表5），表明加入助劑減少20%藥量的同時，各殺菌劑協(xié)同增效組合對梨白粉病的田間防效并未降低。120μg/mL雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+120μg/mL噻肟菌酯、8μg/mL辛菌胺醋酸鹽+40μg/mL噻肟菌酯、40μg/mL醚菌酯+40μg/mL氟硅唑+0.1%邁道這3個協(xié)同增效組合第3次用藥后7d對梨白粉病的田間防效分別為78.64%、77.00%、75.92%，第3次用藥后15d的田間防效卻高達89.77%、87.07%、87.63%，第3次用藥后30d的田間防效仍高達88.78%、84.45%、81.73%（表5），表明這3個協(xié)同增效組合對梨白粉病的預(yù)防效果更優(yōu)，且持效期較長。2.3不同系統(tǒng)發(fā)育類型病的協(xié)同增效組合同時兼治3種病害且防效較好的協(xié)同增效組合有3個；同時兼治2種病害且防效較好的協(xié)同增效組合有4個；僅對梨褐斑病有較好防效的協(xié)同增效組合有4個；僅對梨白粉病有較好防效的協(xié)同增效組合有1個；僅對梨黑星病有較好防效的協(xié)同增效組合有4個（表6）。可依據(jù)田間發(fā)生的具體病害篩選有針對性的協(xié)同增效組合和有效用藥量，制定梨樹主要病害不同防治時期的有效用藥流程。2.4不同生育期主要病害發(fā)生情況及兼治方案調(diào)查發(fā)現(xiàn)，農(nóng)民整個生育期共使用三唑類殺菌劑7次，苯醚甲環(huán)唑推薦劑量為33.33μg/mL，但實際使用劑量比該推薦劑量高出1倍，存在較高的潛在抗藥風(fēng)險。按照不同生育期主要病害發(fā)生情況及兼治原則，結(jié)合2.1～2.3結(jié)果及輪換交替用藥原則選用辛菌胺醋酸鹽、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+吩嗪α-2羧酸+Tmax、丙硫菌唑+嘧菌酯、醚菌酯+氟硅唑+NF-100、雙胍三辛烷基苯磺酸鹽+噻肟菌酯、氟吡菌酰胺+嘧菌酯替代或輪換用藥（表7）。以協(xié)同增效組合用藥為關(guān)鍵技術(shù)的減量用藥梨樹主要病害綜合防控體系防效達93.15%，較農(nóng)民用藥防效高出12.93個百分點。3藥劑、藥劑協(xié)同增效組合的應(yīng)用效果常用化學(xué)殺菌劑對田間病菌種群的防效逐漸降低，病菌已產(chǎn)生抗藥性。目前生產(chǎn)上防治梨褐斑病選用的殺菌劑主要有多菌靈和甲基托布津（目前，田間梨樹病菌抗藥性種群以甾醇抑制劑和微管蛋白抑制劑為主（目前生產(chǎn)中農(nóng)民盲目將殺菌劑與殺蟲劑混合使用