基因克隆簡介基因克隆簡介1一.DNA分子克隆的基本原理基因克隆（genecloning）或分子克隆,又稱為重組ＤＮＡ技術，是應用酶學方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當?shù)乃拗骷毎羞M行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。克?。╟lone）一指含有單一的DNA重組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細胞建立無性繁殖系的過程(cloning)。一.DNA分子克隆的基本原理基因克隆（genecloni2一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１.獲得待克隆的DNA片段（基因）；

２.目的基因與載體在體外連接；

３.重組DNA分子導入宿主細胞；

４.篩選、鑒定陽性重組子；

５.重組子的擴增與／或表達。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１.獲得待克隆的DNA片31.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質。1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。4基因克隆簡介ppt課件5二.用于基因克隆的工具酶二.用于基因克隆的工具酶61.1、限制酶概念提出的背景

20世紀30年代，微生物學家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。

1962年，W．Arber提出一個假設來解釋上述現(xiàn)象。他認為這是細菌中有2種以上功能不同的酶，一種是核酸內切酶，能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，另一種是修飾酶，可對自生的DNA進行修飾。1.DNA限制性內切酶1.1、限制酶概念提出的背景1.DNA限制性內切酶7限制性內切酶能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內切酶。限制性內切酶能識別并切斷外來DNA分子的某些部81.2、限制性核酸內切酶的命名原則限制酶的命名是采用Smith和Athens提議的方案，即名稱的第個1字母取自它來源細菌屬名的第1個字母，大寫；第2，3二個字母取自它來源細菌的種名的頭2個字母，小寫；如果它的來源菌還有株系，則有第4個字母；最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號。前三個字母用斜體表示。

1.2、限制性核酸內切酶的命名原則9EcoRIEscherichia屬名Coli種類Ry13株系編號若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。如HindⅢ代表從流感噬血桿菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分離到的第3個限制酶。EcoRIEscherichia屬名Coli種類Ry13株101.3、限制性核酸內切酶的分類

根據(jù)其識別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。

I類：不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。Ⅱ類：基因工程的工具酶。Ⅲ類：切割位點不在識別位點，一般離識別位點25bp～27bp，對分子克隆操作亦無實用意義。1.3、限制性核酸內切酶的分類根據(jù)其識別和切割序列的特性11首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與DNA的來源無關。1.4II類限制性內切酶分離的第一個酶是HindⅡ首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在197012（2）切割位點切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：從識別位點處EcoRV5’-GATüATC-3’

3’-CTA?TAG-5’Sam

I5’-GGGCCC-3’3’-CCCGGG-5

EcoRI5’-GüAATTC-3’3’-CTTAA?G-5’PstI5’-CTGCAüG-3’3’-G?ACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickye13（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。GüAATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAA?G5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’（3）粘性末端（stickyends，cohensive14

①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。ii）同一個DNA分子內連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個平齊末端容易的多。①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只15基因克隆簡介ppt課件162.DNA連接酶從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。3.1DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復制一定有斷口。2.DNA連接酶從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能17（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。3.2DNAligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。18基因克隆簡介ppt課件19（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：

NAD+2.連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH20基因載體是一類能自我復制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細胞。三.分子克隆的載體基因載體是一類能自我復制的DNA分子，其中的一段DNA21載體具以下特征：

1)具有自主復制能力；2）有可選擇的標記基因（如，抗藥基因）3）有多種限制酶切點，每種限制酶最好只有單一切點；4）分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進入宿主細胞并在其中增殖；被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復制能力

5）使用安全?？寺≥d體應只存在有限范圍的宿主，在體內不進行重組，不發(fā)生轉移，不產(chǎn)生有害性狀，并且不能離開宿主自由擴散。載體具以下特征：

22多克隆位點ori復制起始點遺傳標記Amppolylinker常用的載體有：質粒，λ噬菌體，粘粒，病毒，BAC，YAC等。多克隆位點ori復制起始點遺傳標記Amppolylinker231.質粒(plasmid)載體

Plasmid獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

Plasmidchromosome

1.質粒(plasmid)載體

Plasmid獨立于細241、質粒是細菌染色體外能自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質粒叫R質粒。3、根據(jù)每個寄主細胞中質?？截悢?shù)的多少，把質粒分為嚴緊型復制質粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復制質粒（拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝）。4、質粒的不親和性：兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。1）質粒的一般生物學特性1、質粒是細菌染色體外能自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子。1）25（1）分子量大，拷貝數(shù)低2）天然質粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子長

9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr

作為篩選標志。（2）篩選標志不理想ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內部。（1）分子量大，拷貝數(shù)低2）天然質粒的局限性第一個用于基因克26

第一階段（1977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。

3）發(fā)展概況pBR322質粒是由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質粒的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來源于pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）。

pBR322質粒

第一階段（1977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如27基因克隆簡介ppt課件28pBR322質粒載體優(yōu)點：

第一，具有較小的分子量。pBR322質粒DNA分子為4363bp。

第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。

第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后，每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。這就為重組DNA的制備提供了極大的方便。pBR322質粒載體優(yōu)點：29基因克隆簡介ppt課件30抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板T31第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的篩選標記基因。如pUC系列載體。

2.7kb第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新32ＯＰZ編碼β-半乳糖苷酶：將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。lacZ的a肽互補藍白斑選擇原理：①乳糖操縱子ＯＰZ編碼β-半乳糖苷酶：將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。lac33異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside：IPTG）結構上類似于別乳糖，是乳糖操縱子非常有效的誘導物。可誘導lac操縱子表達，但不能被β-半乳糖苷酶水解。②異丙基硫代半乳糖苷IPTG異丙基硫代-β-D-半乳糖苷Isopropyl-beta-D-thiogalactoside異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalact34③

Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖糖苷③Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-ind35b-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質5-溴-4-氯靛藍。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍b-半乳糖苷酶b-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍36lacZ的a肽互補1）a-肽（lacZ’

）：b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸），該段基因序列連接到pUC載體上。受體菌基因組的b-半乳糖苷酶基因的缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成活性酶，不能分解XgallacZ的a肽互補1）a-肽（lacZ’）：b-半乳糖苷37pUC質粒載體上的lacZ’

編碼a肽與這個缺失突變的b-半乳糖苷酶“互補”，又能分解Xgal。產(chǎn)生藍色物質。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受體菌lacZ載體lacZ’與a互補pUC質粒載體上的lacZ’編碼a肽與這個缺失突變的b-半38a互補的插入失活pUC載體上LacZ’的5‘端有一段多克隆位點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。不能互補。

lacZ’5’3’a肽移碼突變lacZ’5’3’a肽不互補互補MCS外源DNAa互補的插入失活pUC載體上LacZ’的5‘端有一段多克隆位39通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無插入時，互補，藍菌斑。MCS有插入時，不互補，白菌斑。IPTG誘導的結果：通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MC40基因克隆簡介ppt課件41第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。T7啟動子SP6啟動子MCSlacZ’Amprori第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M142

將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。

理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。1）基因文庫的構建（1）基因文庫（genelibrary）1.目的基因片段的獲得四.DNA的克隆過程將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片43（2）

基因組文庫的構建1、提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，2、載體DNA的制備；3、DNA片段與載體連接與包裝

；4、重組噬菌體侵染受體菌；5、基因文庫的鑒定和擴增（2）基因組文庫的構建1、提取研究對象基因組DNA，制44基因克隆簡介ppt課件45

原位雜交，是將細菌菌落影印到濾膜上，或將菌種點種在濾膜上然后再生長出可見的菌落，對濾膜上的菌體進行原位裂解使DNA釋放出來，并使之固定在濾膜上并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。

原位雜交主要用來從用質?；駽osmid構建的基因文庫中尋找陽性克隆，當?shù)玫疥栃钥寺『?，再通過Southern雜交進一步驗證。通過這種方法在一張直徑為9cm的濾膜上，可檢測成幾百到一千甚至上萬個菌落，達到高通量篩選的目的。（3）基因文庫的篩選原位雜交，是將細菌菌落影印到濾膜上，或將菌種點種在濾46原位雜交原位雜交47（1）cDNA以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。（2）cDNAlibrary2）cDNA文庫的構建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。（1）cDNA以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。48（1）不含內含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構建。（4）

構建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提?。?）cDNA文庫的特點提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。（1）不含內含子序列。（4）構建cDNA文庫的一般步驟（149（2）mRNA的分離純化（2）mRNA的分離純化50（3）cDNA的合成用OligodT（或隨機引物）作引物，逆轉錄酶能以RNA為模板合成cDNA。（4）cDNA與載體連接在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌。（3）cDNA的合成用OligodT（或隨機引物）作引物，51基因克隆簡介ppt課件52

適用于分離在特定組織中表達的基因、在細胞周期特定階段表達的基因、受生長因子調節(jié)的基因、以及在特定發(fā)育階段表達的或是參與發(fā)育調節(jié)的基因，同時也可有效地用來分離經(jīng)特殊處理而被誘導表達地基因。

3）mRNA差別雜交或扣除雜交法分離目的基因適用于分離在特定組織中表達的基因、在細胞周期特定階段534）PCR擴增獲得目的基因PCR(Polymerasechainreaction),聚合酶鏈式反應是DNA的體外酶促擴增。是利用兩個短的單鏈引物，在體外快速擴增特異DNA片段的技術。應用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復循環(huán)，使目的DNA片段在一定時間以指數(shù)方式增加百萬倍。（1）PCR的概念4）PCR擴增獲得目的基因PCR(Polymerasec54（2）［PCR原理］

類似于DNA的天然復制過程，PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA解離，使之成為單鏈；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；（2）［PCR原理］類似于DNA的天然復制過程，PCR由55③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補鏈每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，重復循環(huán)：變性--退火--延伸三過程，就可2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。模板DNA變性引物DNA復性引物DNA延伸③引物的延伸：模板DNA變性引物DNA復性引物DNA延伸56基因克隆簡介ppt課件57基因克隆簡介ppt課件58（4）.PCR技術的應用（1）擴增某一段DNA從基因組中擴增；從載體上擴增；組織樣本原位擴增；cDNA擴增；分析模板序列；（2）基因的體外誘變（4）.PCR技術的應用（1）擴增某一段DNA從基因592.目的DNA片