專題5

DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)湖南邵東三中楊連進(jìn)專題5湖南邵東三中楊連進(jìn)課題1DNA的粗提取與鑒定課題1的粗提取與鑒定ppt課件在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol／L時(shí)，DNA的溶解度最大，濃度為0．14mol／L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出②如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離6、DNA在酒精溶液中的溶解性7、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80°C的高溫，而DNA在80°C以上才會(huì)變性③洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對DNA沒有影響DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利8、DNA的鑒定①DNA與二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑②紫外燈照射法A、配制染色劑，用蒸餾水配制萬分之五的溴化已錠（EB）B、將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上，再滴一滴EB溶液染色C、將蠟紙放在紫外燈(260nm)下照射（暗室中），可見橙紅色的熒光(DNA的紫外吸收高峰在260nm處)③甲基綠（藍(lán)綠色）8、DNA的鑒定①DNA與二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此二、DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取2～3種實(shí)驗(yàn)材料）2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大二、DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取動(dòng)物細(xì)胞的破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？動(dòng)物細(xì)胞的破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水①植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜2、植物細(xì)胞討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解②實(shí)例：提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行從分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液①植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜2、植物細(xì)胞討答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等討論：如果研磨不充分，會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？（三）去除濾液中的雜質(zhì)為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量討論：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)討論：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)答：用高鹽濃討論：方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。討論：方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶的粗提取與鑒定ppt課件（四）DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95％），靜置2－3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出（四）DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體積相等的的粗提取與鑒定ppt課件2、DNA的鑒定鑒定DNA時(shí)在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色2、DNA的鑒定鑒定DNA時(shí)在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為（一）案例一：以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取三、實(shí)驗(yàn)案例②雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長1、雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料的原因①雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得（一）案例一：以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取三、實(shí)驗(yàn)案例2、實(shí)驗(yàn)原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14mol／L時(shí),DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。2、實(shí)驗(yàn)原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaC3、實(shí)驗(yàn)材料和用具：雞血細(xì)胞液（5~10ml）；體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液（實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻24h）；蒸餾水；質(zhì)量濃度為0．１g/ml的檸檬酸納溶液；務(wù)質(zhì)量的濃度分別為2mol/L和0．015mol/L的氯化納溶液；二苯胺試劑。鐵架臺(tái)；鐵環(huán)；鑷子；三角架；酒精燈；石棉網(wǎng)；載玻片；玻璃棒；濾紙；滴管；量筒（100ml，一個(gè)）；燒杯；（100ml，一個(gè)，50ml、500ml各二個(gè)）；試管（20ml，二個(gè)）；漏斗；試管夾；紗布。3、實(shí)驗(yàn)材料和用具：雞血細(xì)胞液（5~10ml）；體積分?jǐn)?shù)為94、課前準(zhǔn)備雞血細(xì)胞液取質(zhì)量濃度為0．1g/ml的檸檬酸納溶液（抗凝劑）100ml，置于500ml燒杯中。注入新鮮的雞血（約180ml），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸納溶液充分混合，以免凝血。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，精置一天，使血細(xì)胞自行沉淀。（也可以將血液倒入離心管內(nèi)，用1000r/min（轉(zhuǎn)每分）的離心機(jī)離心2min，血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實(shí)驗(yàn)時(shí)。用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。）①過程4、課前準(zhǔn)備雞血細(xì)胞液取質(zhì)量濃度為0．1g/ml的檸檬酸納溶②檸檬酸鈉作用防止血液凝固③作用機(jī)理檸檬酸鈉能與血漿中的Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液就不會(huì)凝固雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液④注意事項(xiàng)②檸檬酸鈉作用防止血液凝固③作用機(jī)理檸檬酸鈉能與血漿中的Ca討論：提取雞血中的DNA時(shí)，為什么除去血液中的上清液？答：血液分為兩部分，一部分是血漿，一部分是血細(xì)胞，離心后除去的上清液是血漿5、方法步驟將制備好的雞血細(xì)胞液5mL～10mL，注入到50mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過濾至500mL。取其濾液。①提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)討論：提取雞血中的DNA時(shí)，為什么除去血液中的上清液？答：血的粗提取與鑒定ppt課件討論：答：讓細(xì)胞內(nèi)濃度大于周圍溶液的濃度，細(xì)胞會(huì)吸水以至脹破（1）為什么要加入蒸餾水？加入蒸餾水后細(xì)胞會(huì)有什么變化？（2）用玻璃棒攪拌有什么意義？答：用玻璃棒攪拌可以加速血細(xì)胞和細(xì)胞核的破裂。注意應(yīng)沿一個(gè)方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）濾去的是什么物質(zhì)？得到的是什么？答：過濾將濾去的是細(xì)胞膜和核膜等物質(zhì)；得到的是與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合在一起的DNA討論：答：讓細(xì)胞內(nèi)濃度大于周圍溶液的濃度，細(xì)胞會(huì)吸水以至脹破②溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol的溶40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸餾水（這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14mol／L）③析出含DNA的粘稠物②溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol的的粗提取與鑒定ppt課件討論：加入蒸餾水的目的？降低NaCl溶液濃度到使DNA溶解度最低點(diǎn)，使DNA從NaCl溶液中析出將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞注意事項(xiàng)：討論：加入蒸餾水的目的？降低NaCl溶液濃度到使DNA溶解度④濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至500mL的燒杯中，含DNA的粘稠物被留在紗布上⑤將DNA的粘稠物再溶解取1個(gè)50mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol／L的溶液20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢?，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中④濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶的粗提取與鑒定ppt課件⑥過濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個(gè)100mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中⑦提取含雜質(zhì)較少的DNA在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為95％的溶液50mL（使用冷卻的酒精，對DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA⑥過濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個(gè)100mL燒杯，用放有兩的粗提取與鑒定ppt課件答：因?yàn)镈NA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中討論：（2）觀察絲狀物呈什么顏色？答：白色（1）為什么要加50mL的冷酒精？答：因?yàn)镈NA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含取兩支20mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0．015mol／L的溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化