乳與乳制品微生物檢驗(yàn)食品中大腸菌群的檢測YLNB3.21、引用依據(jù)：GB/T4789?3-20032、術(shù)語和定義大腸菌群：指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。3、儀器及器材3.1恒溫培養(yǎng)箱：36±1°C；冰箱：0-4C；3?3恒溫水浴鍋：46±1C；3.4天平；3.5顯微鏡；3.6均質(zhì)器或乳缽；3.7滅菌平皿：直徑90mm；3.8滅菌試管：18X180和20X200；3.9滅菌吸管：1ml和10ml；3.10滅菌廣口瓶或三角燒瓶：容量為500ml；3.11滅菌玻璃珠：直徑約5mm；載玻片；酒精燈；試管架；滅菌刀、剪子、滅菌鑷子等4、培養(yǎng)基和試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管；伊紅美蘭瓊脂平板；乳糖發(fā)酵管；生理鹽水；革蘭氏染色液。5、檢驗(yàn)程序6、方法檢樣稀釋6.1.1以無菌操作將檢樣25ml（或g）放于裝有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8000?10000r/min的速度處理lmin，做成1：10的均勻稀釋液。6.1.2用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml,注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用一支1ml滅菌吸管。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì),選擇三個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種3管。乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：（通常所說的假定試驗(yàn)：其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵產(chǎn)生氣體的細(xì)菌）將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在1ml以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1ml及1ml以下者,用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1°C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。分離培養(yǎng)：（目的在于檢查乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)，有無需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌存在）將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美蘭瓊脂平板上，置36±1C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18?24h,然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)實(shí)驗(yàn)。證實(shí)實(shí)驗(yàn)（復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)）:（目的在于證明從乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體）在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1?2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1°C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陰性。報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)查MPN檢索表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的最可能數(shù)（見表1）。7、注意事項(xiàng)初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)不是純菌的發(fā)酵試驗(yàn)，所以初發(fā)酵陽性并不代表大腸菌群陽性，因此，必須作進(jìn)一步證實(shí)試驗(yàn)。產(chǎn)氣量與倒管試驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量與大腸菌群的檢出率呈正相關(guān)系。但也隨樣品的種類而變。大腸菌群的產(chǎn)氣量多者可充滿整個(gè)倒氣管，少者可產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問，可用手輕輕打動(dòng)試管如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。另外，產(chǎn)氣量與倒氣管有一定的關(guān)系，倒氣管口不完整，有利于氣體的進(jìn)入；管口周圍有沉淀等物質(zhì)能影響氣體的進(jìn)入。挑選菌落在平板呈現(xiàn)紫黑色，有或無金屬光澤，檢出率最高；粉紅色、粉色檢出率最低。另外，只挑選一個(gè)菌落影響大腸菌群的檢出率，當(dāng)菌落不典型時(shí)，應(yīng)挑取2?3個(gè)菌落作證實(shí)試驗(yàn)，以免出現(xiàn)假陰性。抑菌劑大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。膽鹽的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。有些抑菌劑用量甚微，稱量時(shí)稍有誤差，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響，因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法添加。7.5指示劑溴甲酚紫屬于酸堿指示劑，其pH變色范圍為：黃5.2?6.8紫，當(dāng)料管中培養(yǎng)基(pH=7?4±0?1)的顏色由紫色變?yōu)辄S色時(shí)，證明培養(yǎng)基中有酸性物質(zhì)產(chǎn)生，此時(shí)培養(yǎng)基的PHW5.2，培養(yǎng)基呈酸性。MPN檢索表MPN為最大可能數(shù)的簡稱，表示樣品中活菌的密度，是用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給出了三個(gè)稀釋度，如果改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)值應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。7.6.1用于初發(fā)酵試驗(yàn)或復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)的小導(dǎo)管內(nèi)應(yīng)無氣泡，有氣泡時(shí)就不能使用，接種之后，要用同批未接種的發(fā)酵管置于溫箱內(nèi)，同時(shí)培養(yǎng)，作為空白。7.6.2檢查初發(fā)酵試驗(yàn)的乳糖膽鹽管內(nèi)是否有乳糖分解菌存在時(shí)，應(yīng)以產(chǎn)氣為主，產(chǎn)酸僅作參考。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中所用的指示劑為溴甲酚紫，其有效PH為5.2-6.8，變色點(diǎn)為6.0，如果產(chǎn)酸未能達(dá)到使下降至6.0以下時(shí)，變色就不顯著。檢查發(fā)酵管中小導(dǎo)管內(nèi)氣泡時(shí)，即使只有微量氣泡出現(xiàn)，亦應(yīng)判定為陽性。有時(shí)小導(dǎo)管的管口被樣品顆粒封住，氣體未能進(jìn)入導(dǎo)管，如加以振搖，管低有小氣泡上升，亦應(yīng)視為陽性。大腸菌群細(xì)菌能分解乳糖產(chǎn)酸，使伊紅和美蘭結(jié)合而成黑色物，故菌落呈紫黑色（大腸桿菌）或褐色（產(chǎn)氣克雷伯氏菌等），前者有時(shí)還產(chǎn)生有金屬光澤。表1大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表陽性管數(shù)MPN100ml(g)陽性管數(shù)MPN100ml(g)110-110-2110-110-2000<302009000130201140

002602022000039020326001030210150011602112000129021227001312021334002060220210021902212800221202223500231602234200309023029003113023136003216023244003319023353010040300230101703013901021103026401031503039501107031043011111031175011215031212001131903131600

1201103209301211503211500122200322210012324032329001301603302400131200331460013224033211000133290333三24000注：①本表采用3個(gè)稀釋度【0.1g