細胞凋亡與檢測方法匯報人：細胞凋亡與檢測方法匯報人：凋亡(apoptosis)：機體在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程。壞死（Necrosis）：各種致病因子，干擾和中和了細胞的正常代謝活動，造成細胞的意外死亡。一、細胞的死亡方式凋亡(apoptosis)：機體在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的二、細胞壞死與凋亡的比較

壞死

凋亡性質(zhì)病理性、非特異性生理性或病理性，特異性誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生生化特點被動過程，無新蛋白質(zhì)合成，不耗能主動過程，有新蛋白質(zhì)合成，耗能DNA電泳

形態(tài)變化彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細胞腫脹DNA片段化（180—200bp），電泳呈“梯”狀條帶胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮炎癥反應溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應凋亡小體無有基因調(diào)控無有二、細胞壞死與凋亡的比較壞死三、細胞凋亡的生理意義1.確保正常發(fā)育、生長如：指（趾）間隙的形成2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定如：清除受損、突變或衰老的細胞3.發(fā)揮防御功能如：使受到病毒感染的細胞凋亡三、細胞凋亡的生理意義1.確保正常發(fā)育、生長細胞變圓微絨毛消失胞質(zhì)濃縮空泡化凋亡小體

初期：核染色質(zhì)高度濃縮凝集在核周邊,邊集細胞體積縮小中期：胞膜內(nèi)陷出芽濃縮核裂解膜自行分割后期：鄰近的上皮細胞、MΦ、瘤細胞等吞噬凋亡小體四、凋亡時細胞的主要變化

（一）形態(tài)學改變細胞變圓凋亡小體初期：核染色質(zhì)高度濃縮凝集在核周邊,邊集NormalCellApoptoticcellNormalCellApoptoticcell（二）、生化改變

１、DNA片段化－主要特征2、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶（Ｄnase)激活3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活

（二）、生化改變１、DNA片段化－主要特征

內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用H1核心顆粒連接區(qū)180-200bp內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶Zn2+Ca2+Mg2+內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用H1核心顆粒連接區(qū)180-200b五、細胞凋亡的檢測方法

1、形態(tài)學檢測（一）HE染色（凋亡細胞呈圓形，胞漿紅染，細胞核染色質(zhì)聚集成團塊狀）（二）透射電鏡觀察（三）熒光顯微鏡觀察五、細胞凋亡的檢測方法

1、形態(tài)學檢測透射電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

透射電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-熒光顯微鏡

Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1）熒光顯微鏡

Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折2、DNA片斷化檢測細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNAladder的形成2、DNA片斷化檢測細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)細胞凋亡實驗ppt課件3、流式細胞儀檢測flowcytometer（一）PI單染（二）Annexinⅴ/PI雙染色3、流式細胞儀檢測flowcytometer（一）PI（一）PI單染

熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，常用于細胞凋亡檢測，英文全稱是PropidiumIodide。它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。細胞凋亡之初，由于核酸內(nèi)切酶的激活，將DNA從核小體間切斷，產(chǎn)生游離寡核苷酸片段。這些片段彌散到胞漿中，但是細胞膜完整，不能離開細胞。乙醇固定，PBS洗滌，使細胞膜通透性增加，并從細胞漿彌散出胞外。但是大分子DNA在胞內(nèi)，不能被抽提。

（一）PI單染

判斷：在直方圖上，Go/G1期前有一個亞二倍體峰。（檢測晚期凋亡，但不能判斷是晚期凋亡還是壞死）AB判斷：在直方圖上，Go/G1期前有一個亞二倍體峰。AB（二）Annexinⅴ/PI雙染色原理：磷脂酰絲氨酸（PS）主要存在于細胞膜內(nèi)側(cè)，細胞凋亡時，它移向細胞外側(cè)。可能是PS膜內(nèi)外轉(zhuǎn)位酶的早期激活有關(guān)。Annexinⅴ是一種Ca2＋依賴磷脂結(jié)合蛋白，對PS有高度親和性。PS外翻不是凋亡細胞所特有，壞死細胞也可發(fā)生。兩種細胞的區(qū)別在于早期凋亡細胞細胞膜是完整的，而壞死細胞膜完整性受到破壞,可用PI區(qū)分。

（二）Annexinⅴ/PI雙染色原理：磷脂酰絲氨酸（PS檢測標準：早期凋亡細胞：Annexinⅴ-FITC(+)；PI(-)；壞死細胞和晚期凋亡繼發(fā)性壞死細胞：Annexinⅴ-FITC(+)；PI(+)；機械性壞死及非特異性染色：Annexinⅴ-FITC(-)；PI(+)；正常細胞：Annexinⅴ-FITC(-)；PI(-)；檢測標準：C-mycASO200nmol/L

凋亡結(jié)果壞死結(jié)果C-mycASO凋亡結(jié)果壞死結(jié)果4、線粒體膜勢能的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。4、線粒體膜勢能的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，親脂性陽離子熒光探針JC-1以單體形式存在，可發(fā)出綠色熒光（527nm），若以多聚體形式存在，可發(fā)出紅色熒光（590nm）.JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態(tài)進入胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△ψ）具有極性，JC-1依賴于△ψ的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并形成多聚體，發(fā)出紅色熒光（590nm，線粒體）和綠色熒光（527nm，胞液）.而細胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，線粒體內(nèi)紅光強度減弱（590nm），以單體的形式存在于胞液內(nèi)而發(fā)綠色熒光（527nm）.因此在雙色濾光片下觀察，正常細胞為高綠高紅，凋亡細胞為高綠低紅.親脂性陽離子熒光探針JC-1以單體形式存在，可發(fā)出綠色熒光（正常細胞為高綠高紅，凋亡細胞為高綠低紅.正常細胞為高綠高紅，凋亡細胞為高綠低紅.5、Caspase-3活性的檢測Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。5、Caspase-3活性的檢測Caspase家族在介導細胞Westernblot分析caspase-3的活化Caspase3，6，7Caspase-3正常以酶原(32KD)活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成Westernblot分析Caspase-3正常以酶原(原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac