外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備,染色體組型分析外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備,染色體組型分析1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法。掌握人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體標(biāo)本制備。

2、熟悉人類染色體的鏡下檢查和核型分析方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法。掌握人體外周血淋巴細(xì)胞培2實(shí)驗(yàn)原理人體外周血的形成包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板，其中紅細(xì)胞和血小板不能離體培養(yǎng)。每1ml

外周血中一般含有約1～3×106個(gè)小淋巴細(xì)胞，

幾乎都處于G1期或G0期的非增殖狀態(tài)

，一般情況下是不再分裂的。但當(dāng)在培養(yǎng)液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴細(xì)胞受刺激便轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，重新進(jìn)入增殖周期，進(jìn)行有絲分裂。經(jīng)過66～72小時(shí)(三個(gè)周期)的短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得大量的有絲分裂相細(xì)胞，從而進(jìn)行染色體標(biāo)本制備和核型分析。實(shí)驗(yàn)原理人體外周血的形成包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板，31960年的Denver會(huì)議和1963年的London會(huì)議制定了統(tǒng)一的人類染色體命名體制：按照染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比和著絲粒指數(shù)，將常染色體（22對(duì)）按大小用阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)記，順次排列為1～22號(hào)，性染色體用X和Y標(biāo)記；并按染色體大小和著絲粒位置，把人類染色體分為七個(gè)組，用大寫字母A～G表示。1960年的Denver會(huì)議和1963年的London會(huì)議制4人染色體組型及其特征人染色體組型及其特征5實(shí)驗(yàn)材料1.1試驗(yàn)材料:人外周血淋巴細(xì)胞1.2試驗(yàn)用具:離心管、吸管，量筒、載玻片，常規(guī)清洗烘干，培養(yǎng)瓶、、1ml/5ml移液槍,滅菌處理，天平、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、普通冰箱，酒精燈。1.3試劑藥品完全培養(yǎng)基凝血素(PHA)5mg/ml肝素0.2％實(shí)驗(yàn)材料1.1試驗(yàn)材料:人外周血淋巴細(xì)胞6秋水仙素50μg/ml低滲液0.35％KCl固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），臨時(shí)配制Giemsa染液1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時(shí)配制1/15M磷酸緩沖液NaH2PO4&Na2HPO4NaHCO35%（無菌）PH試紙秋水仙素50μg/ml7磷酸緩沖液的配制磷酸緩沖液PH4.49--9.18(1/15M)PH甲液X(ml)乙液Y(ml)PH甲液X(ml)乙液Y(ml)4.490106.98644.940.19.97.71735.290.259.757.58825.590.59.57.75915.91198.049.50.56.24288.29.70.36.47378.549.750.256.64468.689.90.16.81559.18100乙液：一水磷酸二氫鈉,1/15M溶液含9.2g/L甲液：二水磷酸氫二鈉,1/15M溶液含11.864g/L根據(jù)要求的PH值,取X毫升甲液與Y毫升乙液,混合均勻即得.磷酸緩沖液的配制磷酸緩沖液PH4.49--9.18(1/158實(shí)驗(yàn)步驟1培養(yǎng)液的分裝:在無菌室或接種罩內(nèi),用移液管將培養(yǎng)液和其它各試劑劑分裝入玻瓶,每瓶量為:完全培養(yǎng)基3mlPHA20ul肝素一滴用5%NaHCO3調(diào)pH到7.2~7.4,分裝到10ml的培養(yǎng)瓶中（5ml）,用塞子塞緊,置于4℃條件下保藏。用前從冰箱內(nèi)取出,放入37℃恒溫鍋中溫育10分鐘。選取2培養(yǎng)瓶標(biāo)記A，B。實(shí)驗(yàn)步驟1培養(yǎng)液的分裝:在無菌室或接種罩內(nèi),用移液管將培養(yǎng)液92采血:醫(yī)院肘靜脈采血200ul，迅速在無菌條件下將肝素化血液滴入至外周血培養(yǎng)基內(nèi)。3培養(yǎng):置37℃溫箱中培養(yǎng)68~72小時(shí)。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基。4秋水仙素處理:終止培養(yǎng)前2—4小時(shí)，用移液槍向A加入26ul，B加入39ul。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h。2采血:醫(yī)院肘靜脈采血200ul，迅速在無菌條件下將肝素化血105低滲處理:秋水仙素處理完畢后,小心的從溫箱取出培養(yǎng)瓶,將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以1000rpm離心8—10分鐘，棄上清液。然后加入溫浴的低滲液1毫升,用滴管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，補(bǔ)加7ml低滲液。37℃水浴中低滲處理20分鐘。6預(yù)固定:加入0.5ml固定液（預(yù)溫37°C），輕輕混勻后1000rpm離心7—8分鐘。棄上清液。7固定:每支離心管中,加入固定液3ml,2min后用滴管輕輕沖打成懸液,在室溫中固定15分鐘后離心,吸棄上清液。5低滲處理:秋水仙素處理完畢后,小心的從溫箱取出培養(yǎng)瓶,118再固定:加入固定液3毫升,用吸管輕輕打散,室溫下繼續(xù)固定15分鐘。離心，去上清液。9制片:留固定液0.5毫升,用滴管小心沖打成懸液。從冰箱的冰格中或冰水中取出載玻片,每片滴加懸液1~3滴,吹散,在酒精燈火焰上過火。室溫過夜。11染色:用磷酸緩沖液（PH7.4）稀釋后的姬姆薩染色液染色20分鐘,然后倒去染液,用蒸餾水輕輕沖洗.12鏡檢:待稍干后,在顯微鏡下觀察,先用低倍鏡尋找良好的分裂相,然后再用高倍油鏡觀察。8再固定:加入固定液3毫升,用吸管輕輕打散,室溫下繼續(xù)固定12實(shí)驗(yàn)結(jié)果核型分析表核型分析步驟：實(shí)驗(yàn)結(jié)果核型分析表核型分析步驟：13討論

接種的血樣愈新鮮愈好,最好是在采血后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),如果不能立刻培養(yǎng),應(yīng)置于4℃存放,避免保存時(shí)間過久,會(huì)影響細(xì)胞的活力.在培養(yǎng)中成敗的關(guān)鍵,除了至為重要的PHA的效價(jià)外,培養(yǎng)的溫