酵母雙雜交系統(tǒng)

技術介紹

21August2023寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司酵母雙雜交系統(tǒng)

技術介紹

主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)常見問題分析主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clonte背景介紹:關注蛋白質蛋白質相互作用研究蛋白組時代蛋白質功能生物信息學的發(fā)展背景介紹:關注蛋白質蛋白質相互作用研究蛋白組時代蛋白質功能背景介紹:為什么要研究蛋白互作？發(fā)現新的蛋白質和蛋白質的新功能在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用篩選藥物的作用位點研究藥物對蛋白質之間相互作用的影響建立基因組蛋白連鎖圖背景介紹:為什么要研究蛋白互作？發(fā)現新的蛋白質和蛋白質的新背景介紹:Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)的功能發(fā)現新的與已知蛋白互作的蛋白鑒定兩個蛋白之間的相互作用確定蛋白相互作用的區(qū)域背景介紹:Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)的功能發(fā)現新的與背景介紹:Clontech分子生物學工具ClontechMatchmaker?GeneFunctionGeneExpressionGenediscovery背景介紹:Clontech分子生物學工具ClontechG背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)酵母單雜交-蛋白與DNA的相互作用Matchmaker?GoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem（630491）酵母雙雜交-蛋白與蛋白的相互作用Matchmaker?GoldYeastTwo-HybridSystem（630489）Makeyourown“Mate&Plate?”librarySystem(630490)酵母三雜交—三個蛋白之間的相互作用pBridgeThree-HybridVector（630404）背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)酵母單雜交-背景介紹:Matchmaker

Gold系統(tǒng)原理ReporterGene酵母單雜交酵母雙雜交酵母三雜交ReporterGeneReporterGene背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)原理Repor主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)常見問題分析主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clonte基本原理:酵母雙雜交參考文獻Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用基本原理:酵母雙雜交參考文獻Nature.1989Ju基本原理:GAL4轉錄因子的結構ADDNA-BDGAL4蛋白具有兩個功能結構域BD結合結構域AD激活結構域基本原理:GAL4轉錄因子的結構ADDNA-BDGAL4基本原理:GAL4轉錄因子的分子機理在GAL4based雙雜交系統(tǒng)中:正常情況在酵母細胞內:PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDReporterGeneGAL4AD基本原理:GAL4轉錄因子的分子機理在GAL4based基本原理:三個啟動子，四個報告基因獲得陽性克隆子報告基因表達AbA抗性篩選Ade營養(yǎng)篩選His營養(yǎng)篩選X-a-gal藍白篩選M1G1G2降低假陽性！基本原理:三個啟動子，四個報告基因獲得陽性克隆子報告基因表主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)常見問題分析主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理ClonteClontechMM系統(tǒng)的優(yōu)點SMART方法與同源重組技術結合構建文庫，聰明的酵母自己做克隆。AbA抗性篩選的添加，有效抑制背景生長，大大降低假陽性。文庫構建于型酵母菌株α型Y187中，方便后續(xù)與a型菌株Y2HGold進行mating直接篩選。ClontechMM系統(tǒng)的優(yōu)點SMART方法與同源重組技術ClontechMM系統(tǒng):蛋白互作基本流程驗證蛋白互作自己構建文庫：630490預制細菌文庫：638802（傳統(tǒng)型）預制酵母菌文庫：630480（均一化，通用型）

Clontech蛋白互作相關試劑盒文庫篩選文庫構建酵母雙雜交系統(tǒng)：630489酵母菌轉化試劑盒：630439酵母培養(yǎng)基（套裝）：630495插入片段檢測：630497酵母質粒提?。?30467體內驗證：630489630305體外Co-IP驗證：630458630459631723631604ClontechMM系統(tǒng):蛋白互作基本流程驗證蛋白互作自文庫構建:ClontechMM文庫構建方法SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGG文庫構建:ClontechMM文庫構建方法SMART合SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmating聰明的酵母自己做克隆SD/Leu-Y187同源重組SMARTcDNA

兩小時構建文庫文庫構建:ClontechMM文庫構建方法SMART合成cDNA共轉化，涂板培養(yǎng)，收集菌液文庫分SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingSD/Leu-文庫構建:ClontechMM文庫構建方法SMART合成cDNA共轉化，涂板培養(yǎng)，收集菌液文庫分文庫構建:ClontechMM自制文庫篩選SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingY187，AD文庫Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A文庫構建:ClontechMM自制文庫篩選SMART合文庫篩選:ClontechMM文庫篩選630489Matchmaker?GoldYeastTwo-HybridSystem兩個載體兩個菌株轉化試劑盒control630489Y187Y2HGold三個載體陽性對照，陰性對照。BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7630439極大提高轉化率可以單獨購買文庫篩選:ClontechMM文庫篩選630489M文庫篩選:ClontechMM系統(tǒng)質粒誘餌載體InY2HGold文庫篩選:ClontechMM系統(tǒng)質粒誘餌載體文庫篩選:誘餌載體構建及其自激活檢測Y2HGold誘餌載體SD-Trp/X/A文庫篩選:誘餌載體構建及其自激活檢測Y2HGoldSD-文庫篩選:Mating方法篩選Y187α型DDO篩選二倍體Y2HGolda

型Mating接合反應

酵母的有性生殖過程，Clontech利用這個過程，實現了文庫篩選。

ADBDMixMatingQDO篩選文庫篩選:Mating方法篩選Y187DDO篩選二倍體Y2文庫篩選:均一化通用文庫篩選均一化通用型文庫高豐度與低豐度均衡大大降低工作量大大降低假陽性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.libraryY187，AD文庫Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A文庫篩選:均一化通用文庫篩選NormalizedY187，文庫篩選:傳統(tǒng)細菌文庫篩選文庫培養(yǎng)提取質粒轉化酵母菌取1ml菌液按照一定比例用LB稀釋，150ul/板進行涂板，過夜培養(yǎng)。將提取的質粒轉化Y187，獲得酵母文庫。Mating篩選將文庫與誘餌培養(yǎng)液混合，進行Mating。涂篩選板，挑取陽性克隆子。刮取平板上的菌落，提取質粒。文庫篩選:傳統(tǒng)細菌文庫篩選文庫培養(yǎng)提取質粒轉化酵母菌取文庫篩選:驗證陽性克隆子（PCR確認）25ul2×mix30PCRcycles25ulH2O630497Matchmaker?InsertCheckPCRMix2文庫篩選:驗證陽性克隆子（PCR確認）25ul2×mix文庫篩選:酵母質粒提取630467EasyyeastPlasmidIsolationKit文庫篩選:酵母質粒提取630467Easyyeast驗證互作:體內驗證SEAP630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2驗證互作:體內驗證SEAP630305驗證互作:體外Co-IP驗證BaitAcGFP1PLPreyProteinA/GAgarosebeadsMatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）

驗證互作:體外Co-IP驗證BaitAcGFP1PLPre驗證互作:體外Co-IP驗證實驗流程PL檢測驗證互作:體外Co-IP驗證實驗流程PL檢測驗證互作:FRET分析632466pDsRed-Monomer-C1Vector632470pAcGFP1-C1-Vector驗證互作:FRET分析632466pDsRed6324ClontechMatchmaker系統(tǒng)產品選擇指南ClontechMatchmaker系統(tǒng)產品選擇指南TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim…-ThePlantCell…,2011-AmSocPlantBiolExtracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptorα(ERRα)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi…-JournalofBiological…,2011–ASBMBWSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki…-Cellular…,2011–ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong…-JournalofCellular…,2011-WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanP‐glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrándiz‐Huertas…-…JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao…-PlantandCell…,2011-JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1

TKiyomitsu,HMurakami…-MolecularandCellular…,2011-AmSocMicrobiol

ClontechMatchmaker系統(tǒng)近期參考文獻TheFRIGIDAComplexActivates主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)常見問題分析主要內容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clonte常見問題分析:酵母雙雜交文庫如何獲得？購買Clontech公司預制文庫用630490自己構建文庫請Takara公司提供文庫構建服務如何獲得酵母雙雜交文庫常見問題分