海帶多糖對損傷內(nèi)皮細胞vWF釋放和基因體現(xiàn)影響

導師：謝露專家碩士：王麗萍1/17立題根據(jù)1）

海洋蘊涵著生物種類80%以上,是生物多樣性巨大儲存庫。我國海帶資源豐富,海藻類藥品及保健品開發(fā)始終是國內(nèi)外研究熱點。它大部分生物活性和其主要成份與多糖密切有關.褐藻糖膠具有顯著抗凝血藥理學活性，其副作用少，可作為預防血栓形成藥品或保健，且起源豐富。2/172)

多種心血管疾病如動脈粥樣硬化（AS）,高血壓均易形成血栓，從而造成心，腦，腎等事件發(fā)生。目前，對AS，高血壓發(fā)病機制已逐漸偏重于血管內(nèi)皮細胞，以為內(nèi)皮細胞功能紊亂及其調(diào)控障礙也許是其發(fā)病關鍵。大量分子生物學試驗研究表白:vVWF是一種由血管內(nèi)皮細胞和巨核細胞合成和釋放大分子糖蛋白,功能一是介導血小板黏附于受損血管壁，能與血小板糖蛋白Ⅰb-Ⅸ和內(nèi)皮下膠原結(jié)合,成為血小板粘附在3/17

內(nèi)皮下橋梁,還能與纖維連結(jié)蛋白一起與血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa結(jié)合,誘導血小板聚集,參與血栓形成。二是在循環(huán)中與FⅧ:C結(jié)合并穩(wěn)定其活性。因此，vWF在血液凝固和血栓形成中發(fā)揮了主要作用。當內(nèi)皮細胞受刺激活化或損傷時，vWF釋放會增加，血漿vWF水平就會增高。因而血漿vWF水平變化即可作為血管內(nèi)皮損傷一種敏感指標，反應內(nèi)皮細胞損傷程度，也可反應血管內(nèi)血小板粘附、聚集和血栓形成趨向。因此海帶多糖保護血管內(nèi)皮細胞、減少內(nèi)皮細胞釋放vWF研究對基礎研究和臨床應用有著十分主要意義。4/173）

伴隨近代藥理和臨床深入研究和儀器分析發(fā)展，對海帶營養(yǎng)成份和生物功能尤其是多糖組分有了深入結(jié)識，海帶多糖具有免疫調(diào)整、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗疲勞、降脂、抗血栓、降血糖、放射防護等方面生物活性。在其抗血栓研究中發(fā)覺，海帶多糖具有抗凝血、促纖溶、減少血粘度、減少血脂、抑制紅細胞和血小板聚集，以及改善微循環(huán)藥理活性。在海帶多糖對內(nèi)皮損傷大鼠血小板活性試驗成果中提醒，海帶多糖在減少大鼠血小板粘附率和表面粘附聚集活性同步，也減少血漿vWF水平。5/17研究目1）從細胞生物學水平和分子生物學水平研究海帶多糖抗血栓形成機制。預期海帶多糖抗凝血作用，與其能抑制受損內(nèi)皮細胞釋放vWF、保護內(nèi)皮細胞有關。2）為臨床心腦血管血栓形成疾病新藥研制開發(fā)提供試驗室根據(jù)。6/17科研設計方案◆海帶多糖提取(已完成）◆動物模型建立◆細胞培養(yǎng)建立模型◆測定所需指標，進行統(tǒng)計學處理。7/17

動物試驗

9，15時腹腔注射正常對照組生理鹽水對照組海帶多糖組阿司匹林組生理鹽水生理鹽水海帶多糖阿司匹林連續(xù)給藥三天制備動靜脈環(huán)流血栓模型測血栓濕重，對比各組對血栓形成影響用ELISA法測血漿中Vwf水平

取血漿離心取血后抗凝8/171.首先預試驗確定海帶多糖最適濃度（由師姐試驗已完成）2.確定阿斯匹林最適濃度。9/173.大鼠分為四組，分別為正常對照組，生理鹽水對照組，海帶多糖組，阿斯匹林組，按上述測出最適劑量分組給藥。三天后制備動靜脈環(huán)流血栓模型：按參照文獻辦法，用3%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉大鼠——分離左側(cè)頸總動脈及右側(cè)頸外靜脈，分別做插管——兩管接口處放一剛絲，然后開放動靜脈環(huán)路10min，中斷血流——迅速取出包裹鋼絲血栓稱重，并減去鋼絲重量，即得血栓濕重——對比各組對血栓形成影響,并取血離心抗凝取血漿，用ELISA法測血漿VWF濃度，觀測對比海帶多糖和阿司匹林各自對血栓形成抑制作用。10/17細胞培養(yǎng)試驗內(nèi)容1測加入不一樣物質(zhì)培養(yǎng)液中細胞分泌vWF水平，篩選處于對數(shù)生長期細胞，用腎上腺素刺激引發(fā)內(nèi)皮細胞損傷，觀測不一樣原因?qū)E刺激內(nèi)皮細胞釋放vWF影響1）不一樣濃度NE對內(nèi)皮細胞影響ELISA法測定培養(yǎng)液中vWF水平。2） 海帶多糖對NE刺激內(nèi)皮細胞釋放VWF影響ELISA法測定培養(yǎng)液中vWF水平。3）阿司匹林對NE刺激內(nèi)皮細胞釋放VWF影響ELISA法測定培養(yǎng)液中vWF水平。11/17細胞培養(yǎng)試驗內(nèi)容2電鏡：電鏡下觀測細胞超微構(gòu)造，看細胞內(nèi)W－P小體分泌vWF情況并觀測其他細胞器是否損傷，判斷海帶多糖對內(nèi)皮細胞保護作用。透射電鏡適于觀測細胞內(nèi)超微構(gòu)造，但觀測樣品必須很薄，約50~80nm。超薄切片技術大體分為取材、固定、脫水、浸透、包埋、切片及染色等幾個步驟，詳細步驟略。12/17細胞培養(yǎng)試驗內(nèi)容3

取培養(yǎng)細胞經(jīng)裂解后提取RNA，設計特異性引物，行RT－PCR測各試驗組中內(nèi)皮細胞vWF體現(xiàn)。13/17關鍵技術1.海帶多糖提取、判定及純品分離制備。（已完成）2.造大鼠動靜脈環(huán)流模型，稱血栓濕重，取血離心，ELISA法測血漿中vWF濃度。3.選擇臍靜脈細胞株進行試驗，篩選處于對數(shù)生長期細胞進行細胞試驗，LISA法測定培養(yǎng)液vWF濃度。4.電鏡下觀測WP小體，看其中vWF分泌情況以及各細胞器，以此判斷海帶多糖對內(nèi)皮細胞保護作用。5.用定量PCR技術檢測vWF基因體現(xiàn)情況。14/17統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以X±

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進行studentt檢驗或方差分析15/17預期成果

預期海帶多糖抗凝血作用，與其能抑制受損內(nèi)皮細胞釋放vWF、保護內(nèi)皮細胞有關。16/17研究進度

時間完成工作內(nèi)容2023.9---2023.12動物培養(yǎng)模型建立2023.12---2023.12動物細胞培養(yǎng)模型建立