透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌的誘變選育

冠明酸（h-yaluminal，以下簡(jiǎn)稱(chēng)ha）是一種由d-葡萄糖乙酸和n-羥葡萄糖以-1、3和-1和4糖基層糖的形式交替連接的鏈?zhǔn)礁叩冉逃嘣恰Ｄ壳?微生物發(fā)酵法由于原料易得、成本低、所產(chǎn)HA有更高的產(chǎn)量和分子量等原因正逐步取代傳統(tǒng)的從動(dòng)物組織中提取HA,成為生產(chǎn)HA的主要方法針對(duì)產(chǎn)HA的菌株,目前報(bào)道的誘變劑主要有紫外線、1材料和方法1.1原始蘑菇馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)：購(gòu)于國(guó)家獸醫(yī)微生物保藏中心。1.2培養(yǎng)基和儀器(1)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g,牛心浸粉4g,牛腦浸粉16g,蛋白胨10g,MgSO(2)固體培養(yǎng)基：葡萄糖1g,牛心浸粉4g,牛腦浸粉16g,酵母膏10g,瓊脂20g,加水定容至1L,調(diào)pH7.2,1×10(3)血瓊脂平板:購(gòu)于北京軍區(qū)聯(lián)勤部。FT-IR紅外分析儀：美國(guó)ThermoElectron公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京BRAIC公司；掃描電子顯微鏡：日本Hitachi公司；1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1紫外線誘變挑取在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h的菌株,在37°C下180r/min振蕩培養(yǎng)12h進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng),再以10%接種量接入新鮮種子培養(yǎng)基中,進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng),測(cè)定生長(zhǎng)曲線,每隔2h取種子培養(yǎng)液測(cè)定生物量。將二級(jí)種子液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,置于4°C同步誘導(dǎo)1h,取經(jīng)過(guò)低溫同步誘導(dǎo)的種子液,以20%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的種子培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)1h,使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)狀態(tài),然后置于冰浴中保持10min將冰浴處理后的種子液以4200r/min離心10min,倒出上清液后加入等量的無(wú)菌生理鹽水,振搖混勻菌體后,取15mL菌液至無(wú)菌三角瓶,瓶?jī)?nèi)裝有滅菌玻璃珠,振蕩10min以確保所得為單菌懸浮液。紫外線誘變?cè)诎凳抑羞M(jìn)行,誘變后的操作在紅燈下完成：(1)預(yù)熱紫外燈：紫外燈功率20W,照射距離30cm,照射前打開(kāi)紫外燈預(yù)熱20min,使紫外線強(qiáng)度穩(wěn)定。(2)加菌液：選取若干套內(nèi)置玻璃珠的5cm無(wú)菌培養(yǎng)皿,在無(wú)菌條件下分別加入3mL己制備好的菌懸液和磁力攪拌棒,置于距紫外燈30cm處的磁力攪拌器上。(3)照射：?jiǎn)?dòng)磁力攪拌器,打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋的同時(shí)打開(kāi)紫外燈開(kāi)始計(jì)算時(shí)間,分別照射一定時(shí)間后,關(guān)閉紫外燈結(jié)束誘變,并立即蓋上培養(yǎng)皿的蓋,懸浮液照射后在暗室內(nèi)進(jìn)行后培養(yǎng),以避免光復(fù)活對(duì)誘變的影響。(4)突變株分離：將經(jīng)過(guò)誘變的菌液進(jìn)行系列稀釋,涂布于血平板,37°C培養(yǎng)24h,挑取溶血性弱或無(wú)溶血性的菌落,進(jìn)行下一輪誘變。1.4.6數(shù)-照射平板菌落培養(yǎng)將未經(jīng)紫外線或致死率=(未照射平板菌落數(shù)-照射平板菌落數(shù))/未照射平板菌落數(shù)菌液經(jīng)過(guò)誘變處理后1h內(nèi)倒入新鮮的種子培養(yǎng)基中,混勻,37°C靜置培養(yǎng)3h1.5測(cè)量HA含量的測(cè)定HA相對(duì)分子量的測(cè)定[η]=lnη式中：η生物量的測(cè)定：菌液搖勻后測(cè)定光密度OD2結(jié)果與分析2.1蘑菇的測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離純化后,以溴化鉀壓片,用紅外分光光度計(jì)對(duì)其掃描4000cm2.2菌種延遲期和測(cè)定期經(jīng)過(guò)二級(jí)種子培養(yǎng),得到出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線。由圖2的生長(zhǎng)曲線可見(jiàn),在培養(yǎng)的前5h為菌種的延遲期,在第5h～8h為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,在8h以后進(jìn)入恒定期。二級(jí)種子培養(yǎng)后的第7h～8h為菌種對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的后期,適宜進(jìn)行誘變,因此選擇二級(jí)種子培養(yǎng)7h～8h作為出發(fā)菌株誘變適宜的菌齡。2.3紫外線照射的致死率出發(fā)菌株經(jīng)紫外線照射的致死率曲線如圖3所示,紫外線照射60s的致死率為87.1%,照射70s的致死率達(dá)到90.4%,照射90s的致死率為99.6%。出發(fā)菌株經(jīng)2.4出發(fā)菌株nc1150的獲得在血平板上出發(fā)菌株單菌落周?chē)型该鞯娜苎h(huán)。首先用紫外線照射60s對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變,經(jīng)三輪誘變后,獲得溶血性較弱的菌株NC1100,其單菌落周?chē)苎h(huán)變小。然后選擇致死率較高的400Gy照射劑量的圖5為出發(fā)菌株和經(jīng)過(guò)2.5發(fā)酵培養(yǎng)以無(wú)溶血性的突變株NC1150為出發(fā)菌株,采用對(duì)上述菌株進(jìn)行復(fù)篩,首先經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng),再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),每個(gè)菌株做3次重復(fù)。第1次復(fù)篩從上述34個(gè)菌株中篩選出產(chǎn)量較高的10個(gè)菌株再對(duì)這10個(gè)菌株進(jìn)行第2次復(fù)篩,獲得產(chǎn)量較高的49、74、168、194等4個(gè)菌株,分別測(cè)定其HA產(chǎn)量、分子量和發(fā)酵培養(yǎng)后的生物量,由表2可見(jiàn),168號(hào)菌株的上述各項(xiàng)指標(biāo)均高于其它菌株。2.6不同菌株在發(fā)酵培養(yǎng)血平板的情況下,ha產(chǎn)量的傳代培養(yǎng)過(guò)程中見(jiàn)表1對(duì)復(fù)篩獲得的4個(gè)產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),每株菌經(jīng)過(guò)傳代后,首先進(jìn)行種子培養(yǎng),再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),共傳代10次,分別測(cè)定不同菌株傳代后的HA產(chǎn)量、分子量的變化情況,并經(jīng)過(guò)系列稀釋后涂布血平板。4株菌多次傳代涂布血平板后,單菌落周?chē)闯霈F(xiàn)溶血環(huán),表明所獲得的溶血性缺陷型菌株無(wú)回復(fù)突變現(xiàn)象。由圖6可見(jiàn),168號(hào)菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,其HA產(chǎn)量一直保持在150mg/L以上,而49、74、194號(hào)菌株在傳至第6代時(shí),HA產(chǎn)量出現(xiàn)了不同程度的下降,當(dāng)傳代至第10代時(shí),49和74號(hào)菌株的HA產(chǎn)量降至100mg/L以下。圖7表明,4株菌在經(jīng)過(guò)傳代后,所產(chǎn)HA的分子量均有所降低,168號(hào)菌株在傳至第6代時(shí),所產(chǎn)HA的分子量略有上升,并在各菌株中一直保持較高的水平。因此,將168號(hào)菌株確定為目標(biāo)菌株,命名為NC168號(hào)菌株,并進(jìn)行凍干保藏。3以無(wú)溶血性突變株為誘導(dǎo)測(cè)定菌株本研究選擇馬鏈球菌為出發(fā)菌株。在血瓊脂平板上,單菌落溶血環(huán)明顯,表明紅細(xì)胞被完全溶解。HA生產(chǎn)的安全性至關(guān)重要,不產(chǎn)生毒素的生產(chǎn)菌株既可以避免生產(chǎn)過(guò)程中偶然泄漏對(duì)人體健康造成的危害,也可以大大降低分離純化過(guò)程的成本。因此,HA生產(chǎn)菌的誘變首先要得到無(wú)溶血性的突變株。目前報(bào)道的用作產(chǎn)HA菌株的誘變劑主要有紫外線、γ射線、亞硝基胍(NTG)等對(duì)于誘變劑量的選擇,在以去除菌株溶血性為目的誘變中,紫外線處理選擇的是致死率為87.1%誘變劑量,對(duì)于國(guó)內(nèi)外關(guān)于HA生產(chǎn)菌株誘變選育的報(bào)道,多以獸疫鏈球菌為出發(fā)菌株1.3發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)測(cè)定馬鏈球菌菌株經(jīng)活化后,接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,將發(fā)酵液離心去除菌體,上清液用2.5倍無(wú)水乙