乳酸菌破壁技術(shù)的研究

蘑菇是一種重要的工業(yè)蘑菇，在食品發(fā)酵中得到了重要的經(jīng)濟價值。其合成代謝產(chǎn)物具有降膽固醇、降血壓、抗腫瘤和提高機體免疫等作用細(xì)胞破壁方法很多,如:化學(xué)法,如酸熱法、化學(xué)滲透法;物理法,如反復(fù)凍融法、超聲破壁法、機械法和微波法等;生物法,如酶溶法等,各有優(yōu)缺點1材料和方法1.1培養(yǎng)基和儀器菌株Lactobacillus.plantarum1.557本實驗室保存;質(zhì)粒pSIP411山東大學(xué)祁慶生教授惠贈;MRS培養(yǎng)基青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;甘氨酸Promega公司;溶菌酶購自北京索萊寶科技有限公司;革蘭氏染色液購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;Trizol購自Invitrogen公司;RIPA裂解液(強)P0013購自碧云天公司;4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)購自上海寶曼生物科技有限公司。超聲波破碎儀寧波新芝科器研究所;MCO-18M型CO1.2實驗方法1.2.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法將L.plantarum1.557MRS平板培養(yǎng)基上新鮮活化的單菌落挑至5mLMRS液體培養(yǎng)基,37℃靜置培養(yǎng)過夜。12000r/min,離心1min,收集菌體。用1mL預(yù)冷的洗滌液(100mmol/L磷酸緩沖液,10mmol/LEDTA)洗滌菌體,洗滌3次,再用PBS洗滌3次,離心,收集菌體。1.2.2清洗蘇邏輯的測定用5.8mol/LHCl覆蓋氧化鋯磨介,室溫振蕩處理過夜。棄上清,加入滅菌水清洗(每次清洗都要反復(fù)振蕩),共洗10次。最后,放入平皿中鋪散開,75℃烘干備用1.2.3蘑菇壁處理1.2.3.氧化鋯珠研究法用1.5mL離心管稱取0.013g左右的菌體,加入300μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體,再加入1g左右預(yù)冷的氧化鋯珠。放入組織研磨儀中振蕩研磨(振蕩頻率為每秒30次)研磨15min。研磨結(jié)束后,用1mL注射器在研磨后的離心管底部扎一個小孔,并將扎孔的離心管立即放入另一新的預(yù)冷的1.5mL離心管,4℃,5000r/min,離心5min,收集研磨后的蛋白上清和菌體1.2.3.低功率400w熱壓法用1.5mL離心管稱取2管相同重量(0.01g左右)的菌體,加入300μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體。在冰浴條件下分別超聲破碎30min和1h(功率400W,工作30s,間隔30s)。超聲結(jié)束后,4℃,12000r/min,離心5min,收集超聲后的蛋白上清和菌體1.2.3.超聲破碎法用1.5mL離心管稱取2管相同重量(0.01g左右)的菌體,加入300μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體。在冰浴條件下進行超聲破碎20min(功率1500W,工作5s,間隔9s)。超聲結(jié)束后,4℃,12000r/min,離心5min,收集超聲后的蛋白上清和菌體1.2.3.改造ripa裂解液用1.5mL離心管稱取重量為0.013g左右的菌體,加入300μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體。于液氮中反復(fù)凍融3次,每次冷凍時間20min,37℃水浴中解凍20min1.2.3.含溶菌酶的pbs用1.5mL離心管稱取重量為0.013g左右的菌體,將菌體重懸于300μL含溶菌酶(10mg/mL)的PBS(pH8.0)。在37℃水浴中處理30min,處理結(jié)束后,12000r/min,離心5min,收集溶菌酶處理后的蛋白上清和菌體1.2.3.菌株的培養(yǎng)將L.plantarum1.557MRS平板培養(yǎng)基上新鮮活化的單菌落挑至5mL含2%甘氨酸的MRS培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)過夜。然后,按照方法1.2.1收集菌體。1.2.3.氧化鋯珠研磨法用1.5mL離心管稱取2管相同重量(0.013g左右)的菌體。然后,按照方法1.2.3.4反復(fù)凍融菌體3次,解凍后,直接加入1g左右預(yù)冷的氧化鋯珠,放入組織研磨儀中振蕩研磨(振蕩頻率為每秒30次),分別在研磨5min后,10min后取出一管,置于冰上。然后,用1mL注射器在研磨后的離心管底部扎一個小孔,并將扎孔的離心管立即放入另一新的預(yù)冷的1.5mL離心管,4℃,5000r/min,離心5min,收集研磨后的蛋白上清。1.2.3.氧化鋯珠研磨法用1.5mL離心管稱取2管相同重量(0.013g左右)的菌體。然后,按照方法1.2.3.5用溶菌酶處理菌體30min,處理結(jié)束后,分別直接加入1g左右預(yù)冷的氧化鋯珠,接下來按照方法1.2.3.7進行氧化鋯珠研磨和收集研磨后的蛋白上清。1.2.3.氧化鋯珠的制備按照方法1.2.3.6用2%甘氨酸處理菌株并收集處理后的菌體。用1.5mL離心管稱取2管相同重量(0.013g左右)的菌體,分別加入300μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體,再分別加入1g預(yù)冷的氧化鋯珠。接下來按照方法1.2.3.7進行氧化鋯珠研磨和收集研磨后上清。1.2.4蘭染色對分別經(jīng)氧化鋯珠破碎、超聲破碎、反復(fù)凍融、溶菌酶處理、甘氨酸處理的菌體進行革蘭氏染色,按照革蘭氏染色液試劑盒說明書來進行操作。1.2.5sds-采用分析從收集的蛋白上清中各取50μL,直接加入12.5μL5×SDS樣品緩沖液,充分混勻,煮沸5min,各取15μL煮沸后樣品進行12%SDS分析。1.2.6培養(yǎng)基和方法將菌株L.plantarum1.557(已電轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒pSIP411)在MRS平板培養(yǎng)基上活化后的單菌落挑至5mLMRS液體培養(yǎng)基,37℃靜置過夜培養(yǎng)。以1%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接到6mLMRS液體培養(yǎng)基(紅霉素15μg/mL)中,37℃靜置培養(yǎng)4h(OD=0.3左右)。培養(yǎng)4h后,取出3mL菌液加入誘導(dǎo)劑SppIP(100ng/mL),剩余3mL菌液不加誘導(dǎo)劑作為對照。然后,繼續(xù)培養(yǎng)6h。按照方法1.2.1和1.2.3.1進行菌體和蛋白上清的收集。取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的研磨上清各50μL,分別加入500μL含1.25μmol/L4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)的GUSBuffer(pH=750mmol/L磷酸緩沖液10mmol/Lβ-巰基乙醇1mmol/LEDTA0.1%TritonX-100,37℃溫育,觀察顏色變化1.2.7氧化鋯珠研磨法用1.5mL離心管稱取6管相同重量(0.01g左右)的菌體,分別加入300μL預(yù)冷的Trizol并重懸菌體,再分別加入1g左右預(yù)冷的氧化鋯珠。然后,將其中的5管放入組織研磨儀中振蕩研磨(振蕩頻率為每秒30次),另外1管不研磨作為對照。然后,分別在研磨5、10、15、20min后取出一管,置于冰上。接下來按照方法1.2.3.1收集菌體碎片和上清,用上清重懸菌體碎片后,接下來按照Trizol總RNA提取法進行RNA的提取并用NanoDrop2000紫外分光光度儀測定RNA濃度。2結(jié)果與分析2.1一些簡單的中斷方法的分析2.1.1菌體蛋白無法釋放由圖1可知,甘氨酸破壁法(A、B)、反復(fù)凍融破壁法(E、F)僅可使菌壁受到一定程度破壞(破壁處理后,革蘭氏染色菌體變紅),但無法破壞整個細(xì)胞結(jié)構(gòu),菌體蛋白無法釋放。低功率(400W)超聲波破壁法(I、K)在超聲30min后,細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍比較完整,菌體破碎不完全,需要較長時間(1h左右)才可破壞整個細(xì)胞結(jié)構(gòu)。而氧化鋯珠破壁法(G、H)、大功率(1500W)超聲波破壁法(L、M)、溶菌酶破壁法(C、D)這三種方法都可在較短時間內(nèi)(15~30min)破壞完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),使菌體蛋白得到釋放。2.1.2sds-東南角分析由圖1可知,甘氨酸破壁法和反復(fù)凍融破壁法無法有效破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),菌體蛋白釋放不完全。因此,我們只對溶菌酶破壁法、氧化鋯珠破壁法、超聲波破壁法進行了SDS分析。由圖2可知,溶菌酶雖然可以破壞菌體完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),但PAGE條帶的數(shù)目卻缺少許多,說明仍有許多菌體蛋白沒有釋放到上清中。大功率(1500W)超聲波破壁法和低功率(400W)超聲波破壁法的PAGE圖片條帶數(shù)目少且清晰度差,說明菌體蛋白收獲不完全。氧化鋯珠破壁法的PAGE圖片條帶數(shù)目多且清晰度高,說明菌體蛋白收獲較完全。2.2不同復(fù)合方法研磨法結(jié)果比較由圖1、圖2可知,上述幾種破壁方法對乳酸菌的菌壁均有一定程度的破壞作用,為了進一步提高其破壁效率,又將不同的破壁方法相疊加對乳酸菌進行復(fù)合處理。由圖3可知,菌體不經(jīng)任何處理,加入RIPA后直接鋯珠研磨(單純氧化鋯珠破壁法),在研磨5min后,PAGE條帶數(shù)少很多(尤其30kD以下),研磨不充分,但在研磨10min后,PAGE條帶數(shù)多且清晰度高,說明菌體蛋白收獲較完全。對于幾種復(fù)合處理方法,只有甘氨酸-研磨復(fù)合破壁法,在研磨5min后,就達到了單純氧化鋯珠破壁法研磨10min的效果,在破壁時間上略有縮短。而溶菌酶-研磨復(fù)合破壁法,在研磨5min和10min后,在30kD以下的PAGE條帶數(shù)少很多且清晰度差,研磨效果不如單純氧化鋯珠破壁法。對于反復(fù)凍融-研磨復(fù)合破壁法,在破壁效果及破壁時間上也沒有明顯的優(yōu)勢。因此,綜合考慮成本問題、操作的簡捷性以及工藝放大的可行性,單純氧化鋯珠破壁法是一種適用于乳酸菌破壁的快速、高效、經(jīng)濟的破壁方法。2.3氧化鋯珠破壁法提取gus酶從上述革蘭氏染色以及SDS結(jié)果可知,對于乳酸菌的破壁,鋯珠破壁法要優(yōu)于其他幾種處理方法,但考慮到此法所提蛋白的活性問題,接下來又通過GUS酶活力的測定對所提蛋白的活性進行了定性檢測。若以pSIP411為載體表達外源蛋白并通過鋯珠破壁法提取,則GUS酶活力檢測實驗可在檢測所提蛋白活性的同時檢測外源蛋白在乳酸菌中是否表達。如圖4所示,加入底物4-NPG后,誘導(dǎo)表達產(chǎn)生GUS酶的那一管(左)溶液變黃,而未誘導(dǎo)(右)的則不變黃,說明質(zhì)粒pSIP411在菌株L.plantarum1.557中正常表達了GUS酶,且經(jīng)氧化鋯珠研磨提取后仍具有酶活性。說明此方法在蛋白提取過程中未破壞蛋白活性。2.4其他代謝產(chǎn)物菌壁破碎后,不僅可以釋放出內(nèi)源性蛋白,同樣也可以釋放出核酸以及其他代謝產(chǎn)物。以RNA的提取為例,RNA容易降解,所以提取要迅速。圖5中可看出,菌株經(jīng)鋯珠研磨5min后,即可提出較高濃度的RNA,且該法所提取的RNA的OD3反復(fù)凍融法與其他破壁方法的疊加細(xì)胞破壁的方法很多,需要根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇合適的破壁方法。乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌,細(xì)胞壁具有很厚的肽聚糖成分,破壁較為困難。溶菌酶可以通過分解肽聚糖中的β-1,4-葡萄糖苷鍵來破壞菌壁,甘氨酸可以通過取代肽聚糖中N-乙酰胞壁酸短肽上的L-丙氨酸和D-丙氨酸來破壞菌壁實驗過程中發(fā)現(xiàn)上述5種方法對于乳酸菌的破壁均具有一定程度的破壞作用,但一些具有明顯的局限性。甘氨酸破壁法不能達到