不同性別和生長階段對克氏原螯蝦腸道菌群的影響

腸微生物生活在動(dòng)物腸道粘膜和分泌物中。在長期進(jìn)化過程中，它與主人和主人有著極其密切的關(guān)系。在正常生理狀態(tài)下,腸道微生物之間通過相互作用維持著動(dòng)態(tài)平衡,共同影響宿主的營養(yǎng)、免疫、生產(chǎn)性能、生理狀態(tài)和疾病等過程影響腸道菌群穩(wěn)態(tài)的因素有很多,例如宿主基因型、性別、環(huán)境、生長階段和食物等。這在哺乳動(dòng)物中已有廣泛研究,在魚類中的研究也有較多報(bào)道克氏原螯蝦是一種淡水蝦類,是我國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類之一1材料和方法1.1不同性別克氏原螯蝦腸道取樣克氏原螯蝦樣品采集自湖北省武漢市蔡甸區(qū)武漢沃土清源稻蝦供養(yǎng)專業(yè)合作社(30.39°N,113.77°E)。取不同性別,體長約10.00cm的克氏原螯蝦成蝦,用75.0%的酒精進(jìn)行體表消毒,在無菌環(huán)境下分離其后腸,每3—4只蝦腸混成一個(gè)樣品,保證每個(gè)樣品腸道中的內(nèi)容物共計(jì)不低于0.20g,其中雌性3個(gè)樣品,雄性4個(gè)樣品,置于無菌管中,在-80℃下凍存。對克氏原螯蝦的處理嚴(yán)格遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和處理標(biāo)準(zhǔn)。用糞便基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取樣品微生物總DNA。1.2親蝦與苗種的飼養(yǎng)克氏原螯蝦親本采集自武漢沃土清源稻蝦供養(yǎng)專業(yè)合作社。體表用高錳酸鉀浸泡消毒后,置于經(jīng)高錳酸鉀消毒過的水族箱中暫養(yǎng)2周,養(yǎng)殖密度為10只/箱,雌雄性別比例為1:1。養(yǎng)殖用水為經(jīng)過曝氣的自來水,水深(5.00±1.00)cm,水溫(25.00±1.00)℃,L:D為12:12,投喂商業(yè)顆粒飼料(通威集團(tuán)生產(chǎn))。親蝦自然交配產(chǎn)卵,幼蝦孵出后置于另外的水族箱中飼養(yǎng),投喂飼料和飼養(yǎng)條件與成蝦相同。取體長約2.00cm的幼蝦(孵化后1個(gè)月)腸道(10只幼蝦腸道混為1個(gè)樣品)及體長約27.00cm的成蝦(3只成蝦腸道混為1個(gè)樣品),置于無菌管中,在–80℃下凍存。按1.1的方法提取總DNA。1.3pcr和aaxprepna凝膠的制備對16SrRNA的V3—V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增(引物為341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。熱反應(yīng)條件為94.00℃變性5min;94.00℃30s,54.00℃30s,72.00℃30s的30個(gè)循環(huán);最后在72.00℃下延長10min。從1.2%瓊脂糖凝膠上切下PCR產(chǎn)物,并使用AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒(AXYGEN,美國)純化。對每種純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基于Illumina的高通量測序(BGI,中國深圳)。1.4物種多樣性分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾Alpha多樣性是對單個(gè)樣品中物種多樣性的分析Beta多樣性分析是用來比較一對樣品在物種多樣性方面存在的差異大小,包括Bray-Curtis距離、weightedUniFrac距離和unweightedUniFrac距離等。通過QIIME(v1.80)軟件分析各類群在樣品中的含量,進(jìn)而計(jì)算出不同樣品間的Beta多樣性值。2結(jié)果2.1腸道菌群的形成和分類高通量測序的一般分析對2組克氏原螯蝦樣品(4個(gè)雄性樣本,3個(gè)雌性樣本)的腸道微生物進(jìn)行測序,去除低質(zhì)量序列后,共獲得876639條序列,雄性腸道菌群高質(zhì)量序列在122100—133200,雌性高質(zhì)量序列在123068—127654。對每個(gè)樣本獲得的序列按97.0%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分,共得到2039個(gè)OTU。用Alpha多樣性指數(shù)分析雌雄蝦腸道菌群多樣性的差異(表1)。Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著性差異,表明雌雄克氏原螯蝦腸道菌群的Alpha多樣性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異。腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,對OTU進(jìn)行物種分類并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個(gè)分類等級對各個(gè)樣品作物種profiling面積圖和柱狀圖。在門水平上,雌雄克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢菌群(相對豐度>1.0%)組成較為一致,包括變形菌門Proteobacteria(27.3±12.8)%、厚壁菌門Firmicutes(25.7±14.1)%、軟壁菌門Tenericutes(18.8±13.7)%和擬桿菌門Bacteroidetes(18.3±17.3)%等,各優(yōu)勢菌門在個(gè)體間豐度不同,但不具有顯著性差異(圖1)。在屬水平上,除未能歸類的屬外,雌雄克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢菌群的組成較為一致,包括擬桿菌屬Bacteroides(11.8±14.0)%、希瓦氏菌屬Shewanella(6.8±6.5)%、梭菌屬Clostridium(4.8±7.7)%、厭氧桿菌屬Anaerorhabdus(3.8±5.3)%和檸檬酸桿菌屬Citrobacter(1.5±0.7)%等,個(gè)體間相對豐度不同,但不具有顯著性差異(圖2)。腸道菌群Beta多樣性克氏原螯蝦腸道菌群基于Weighted＿UniFrac多樣性距離、Unweighted＿UniFrac多樣性距離及Bray＿curtis多樣性距離的聚類熱圖分析都未顯示出根據(jù)性別進(jìn)行聚類的現(xiàn)象,在雌性和雄性的腸道菌群組成中并未表現(xiàn)出有規(guī)律的差異(圖3)。2.2腸道菌群分析高通量測序的一般分析在去除低質(zhì)量序列后,從8個(gè)樣本中共分離到249813條序列,對獲得的序列按97.0%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分,共得到18186個(gè)OTU。Alpha多樣性指數(shù)分析顯示(表2),Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)有顯著性差異(P<0.05),Simpson和Shannon指數(shù)沒有顯著性差異,表明幼蝦的腸道菌群多樣性高于成蝦。腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)在門水平上,幼蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢門有變形菌門(35.6%)、擬桿菌門(32.0%)、厚壁菌門(17.6%)、軟壁菌門(8.8%)和放線菌門(5.1%)。成蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢門有變形菌門(65.7%)、擬桿菌門(20.4%)、厚壁菌門(9.6%)、放線菌門(0.9%)和疣微菌門Verrucomicrobia(0.7%;圖4a)。雖然成蝦和幼蝦的優(yōu)勢菌群較為一致,但Metastats分析顯示其豐度具有偏向性,有顯著性差異的細(xì)菌門有13個(gè),包括Thermi、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、衣原體門Chlamydiae、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、GN02、浮霉菌門Planctomycetes、變形菌門、SR1、軟壁菌門、TM7和疣微菌門(圖4b)。在屬水平上,成蝦和幼蝦的腸道優(yōu)勢菌群組成差異較大,在幼蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢屬有伯克氏菌目的一個(gè)未歸類屬Unclassified＿Burkholderiales(21.1%)、氫噬胞菌屬Hydrogenophaga(7.6%)、黃桿菌屬Flavobacterium(7.4%)、叢毛單胞菌科的一個(gè)未歸類屬Unclassified＿Comamonadaceae(5.4%)和嗜堿菌屬Alkaliphilus(5.2%);成蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢屬有擬桿菌屬(12.5%)、黃桿菌屬(10.8%)、Paracoccus(9.1%)和毛螺菌科的一個(gè)未歸類屬Unclassified＿Lachnospiraceae(5.5%;圖5a)。Metastats分析顯示,在屬水平上成蝦和幼蝦有顯著性差異的細(xì)菌屬有70個(gè),前20位差異最大的細(xì)菌屬包括枝動(dòng)菌屬M(fèi)ycoplana、不黏柄菌屬Asticcacaulis、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas、嗜堿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬Novosphingobium、Methylopila、鞘脂菌屬Sphingobium、成對桿菌屬Dyadobacter、紅球菌屬Rhodococcus、氫噬胞菌屬Hydrogenophaga、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、Tepidibacter、甲基醌菌屬Demequina、Kaistobacter、曲桿菌屬Ancylobacter、戴爾福特菌屬Delftia、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、Rheinheimera、Methyloversatilis和Sediminibacterium(圖5b)。腸道菌群Beta多樣性PCA分析顯示出按照生長階段,即成蝦和幼蝦分別聚類的結(jié)果(圖6a)。無論基于Unweighted＿UniFrac距離還是Weighted＿UniFrac距離的PCoA分析,都顯示出明顯地根據(jù)生長階段分別進(jìn)行聚類的結(jié)果(圖6b和圖6c)。對測序結(jié)果進(jìn)行Adonis/PERMANOVA分析,基于加權(quán)和未加權(quán)UniFrac距離的分析結(jié)果均顯示出成蝦和幼蝦腸道菌群有顯著差異(P<0.05)。NMDS分析和UPGMA聚類分析也顯示出明顯的根據(jù)生長階段進(jìn)行聚類的情況。進(jìn)一步對測序結(jié)果進(jìn)行Anosim分析,基于加權(quán)和未加權(quán)UniFrac距離的分析結(jié)果均顯示出成蝦和幼蝦腸道菌群的顯著性差異(P<0.05;圖7)。成蝦和幼蝦腸道菌群的比較分析PLS-DA分析顯示成蝦和幼蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)具有顯著性差異;使用R軟件,對豐度前50位的屬進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖,結(jié)果也顯示出其腸道菌群根據(jù)生長階段進(jìn)行聚類的情況(圖8)。幼蝦和成蝦腸道菌群的功能預(yù)測在KEGGpathwaydatabase數(shù)據(jù)庫中對幼蝦和成蝦的腸道菌群進(jìn)行PICRUSt功能預(yù)測,使用R軟件,對豐度前50位的功能類群進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖(圖9)。成蝦和幼蝦腸道菌群的主要功能包括細(xì)胞通訊、膜運(yùn)輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、遺傳信息復(fù)制和修復(fù)和能量代謝等,2個(gè)生長階段差異最顯著的功能有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝、異生素的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。3腸道菌群的多樣性對不同性別克氏原螯蝦腸道菌群進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn),在野外蝦塘養(yǎng)殖下的克氏原螯蝦的腸道菌群不論是在群落多樣性、物種豐度還是菌群功能預(yù)測上,都未體現(xiàn)出性別間的差異,且腸道菌群的個(gè)體差異較大。對成蝦和幼蝦的腸道菌群進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn),不同階段對腸道微生物的群落多樣性、豐度及功能都有顯著影響。3.1腸道菌群的差異有報(bào)道表明,中華絨螯蟹雌雄個(gè)體的腸道菌群并無明顯差異,具有相同的優(yōu)勢細(xì)菌,且菌群豐度隨生長階段發(fā)生的變化在雄蟹和雌蟹中顯示出一致的趨勢3.2腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn),隨著養(yǎng)殖周期的推移,其腸道菌群多樣性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,不同生長階段的優(yōu)勢菌群組成也有所差異在門水平的物種組成和結(jié)構(gòu)上,兩個(gè)階段的優(yōu)勢菌群較為一致,包括變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門等。其中,變形菌門是相對豐度最高的細(xì)菌門,在許多動(dòng)物腸道中都屬常駐菌,腸道微生物群落的失衡通常源于變形菌門豐度的變化,在變形菌門中有許多條件致病菌,其在腸道內(nèi)的比例能夠反映微生態(tài)和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志在屬水平上,成蝦和幼蝦的優(yōu)勢菌群均包括黃桿菌屬、擬桿菌屬和氫噬胞菌屬,是克氏原螯蝦的核心