大腸桿菌質(zhì)粒的克隆及載體啟動子檢測

枯草桿菌是研究最廣泛的原核生物之一，在微生物遺傳研究和工業(yè)應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用。完整的染色體序列以及30%的基因功能的確定,使枯草桿菌成為研究革蘭氏陽性菌遺傳學(xué)和基因工程的模式菌。枯草桿菌的自然感受態(tài)特性使它成為最適宜的基因工程宿主菌之一。在枯草桿菌的基因工程操作中,質(zhì)粒載體都不是來自于其自身,它們基本都來自金黃葡萄球菌、乳球菌等其他革蘭氏陽性菌。而質(zhì)粒的不穩(wěn)定性是影響這一系統(tǒng)的最大障礙。質(zhì)粒的不穩(wěn)定性主要源于他們的滾環(huán)復(fù)制類型,在復(fù)制過程中產(chǎn)生的單鏈DNA影響質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。特別是來自金黃葡萄球菌的pE194和pC194等質(zhì)粒在枯草桿菌中無負(fù)鏈復(fù)制起始功能,因而在復(fù)制過程中會產(chǎn)生大量的單鏈DNA,造成單鏈DNA的積累,引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定。此外,質(zhì)粒的大小也是影響穩(wěn)定遺傳的因素之一,12kb被認(rèn)為是質(zhì)粒穩(wěn)定的上限;和大腸桿1.1材料表面1.1.1菌株和質(zhì)粒大腸桿菌E.coliDH5α,由本實驗室保存;枯草桿菌(B.subtilis)DB104購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CTCC);B.subtilis原養(yǎng)型菌株1A747,B.subtilis質(zhì)粒pGDV1,E.coli質(zhì)粒pDL由BGSC(俄亥俄州立大學(xué)桿菌保藏中心)惠贈。大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18和pBluskm由本實驗室保存;質(zhì)粒pHB201由Bron博士惠贈。1.1.2dna回收及測量方法限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、牛小腸堿性磷酸酶和基因組提取試劑盒購自promega公司;TaqDNA聚合酶、dNTP、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(ASM0431)購自MBI公司;DNA回收試劑盒,質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;分析純鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG,cat#N1127),抗生素購自sigma公司。1.1.3pcr索引引物見表1。測序引物為T7和T3啟動子引物。PCR引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。DNA克隆片段在上海華大基因公司測定序列。1.2方法1.2.1經(jīng)皮樣品,在樣品中分離參考文獻(xiàn),稍作調(diào)整:挑取單菌落,在生長培養(yǎng)基LBSP(胰蛋白胨1%;酵母提取物0.5%;NaCl1%;蔗糖250mmol/L;磷酸鹽450mmol/L,pH7.2)中過夜培養(yǎng),以1∶50比例,37℃擴(kuò)大培養(yǎng)2～3h至OD600約1.0。冰浴10min。離心集菌(5000g,10min,4℃),棄上清。用洗液SHMG(蔗糖250mmol/L;Hepes1mmol/L;MgCl20.5mmol/L;甘油10%,pH7.0),反復(fù)洗滌沉淀4次(5000g,10min,4℃)。最后用SHMG重懸沉淀并稀釋至2mL,以100μL每管分裝至潔凈的1.5mL的EP管中。用Eppendorf電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化(0.2mm的電轉(zhuǎn)杯,2500V,5ms)。在1mL的LBSPG(LBSP加甘油10%)中37℃搖床上恢復(fù)培養(yǎng)1h,涂板過夜培養(yǎng)。1.2.2中間載體pe3的擴(kuò)增以大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18為模板擴(kuò)增了700bp的pMB1復(fù)制子(引物ORI-1和ORI-2),在擴(kuò)增片段的5′端引入限制性內(nèi)切酶識別位點ApaI,3′端引入限制性內(nèi)切酶BglII和KpnI的識別序列。將該擴(kuò)增片段克隆到pBluskm的ApaI和KpnI位點間,得到中間載體pE3。以革蘭氏陽性菌質(zhì)粒pGDV1為模板,用引物pGDV1-1-up和pGDV1-1-down擴(kuò)增了2.5kb的片段。在其5′端和3′端分別引入BamHI和SacI位點。BglII和SacI消化中間載體pE3,回收700bp的大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子片段,與BamHI和SacI消化的擴(kuò)增片段連接轉(zhuǎn)化,得到穿梭載體pGJ103。用BamHI和SacI消化質(zhì)粒pDL,回收2.2kb的革蘭氏陽性菌熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶基因(bga),克隆到pGJ103構(gòu)建啟動子檢測載體pGJ199,以pHB201為模板擴(kuò)增350bp的P59啟動子片段(引物為P59-up和P59-down),克隆至pGJ199得到P59啟動子檢測載體pGJ201。1.2.3細(xì)菌分離和鑒定方法參照文獻(xiàn)等,以培養(yǎng)基為空白對照,適當(dāng)倍數(shù)稀釋的菌液用分光光度計測定595nm處的吸光值OD595;取2mL待測菌液10000g,4℃離心1min,用2mL的ZBuffer(60mmol/LNa2HPO4·7H2O,40mmol/LNaH2PO4,10mmol/LKCl,1mmol/LMgSO4·7H2O,50mmol/Lβ-巰基乙醇,pH7.0)重懸沉淀。取200μL重懸液,加入1.4mLZBuffer、TritonX-100(10%,V/V)和溶菌酶(10mg/mL)各20μL?；靹?37℃溫育30min裂解細(xì)菌,加入4mg/mL的ONPG400μL。55℃反應(yīng)15min,加入1mol/L的Na2CO31mL終止反應(yīng)。反應(yīng)液10000g,4℃離心3min,取上清測定420nm處吸光值OD420。酶活值為1000×OD420/OD595×15即66.7×OD420/OD595MillU(密勒單位)2結(jié)果與分析2.1擴(kuò)增中間載體pgdv1和bamhi、saci及耐藥基因片段的擴(kuò)增以大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18為模板擴(kuò)增了700bp的pMB1復(fù)制子,將該擴(kuò)增片段克隆到pBluskm的相應(yīng)位點間,得到中間載體pE3,酶切鑒定結(jié)果正確(圖1)。在pE3中復(fù)制子片段的3′端留有BglII和KpnI位點,在5′端有12個常用的單一限制性內(nèi)切酶識別位點,是一個極為方便靈活的中間載體。以革蘭氏陽性菌質(zhì)粒pGDV1為模板擴(kuò)增了2.5kb的片段。該片段含有革蘭氏陽性菌質(zhì)粒的正鏈和負(fù)鏈復(fù)制子以及在大腸桿菌和枯草桿菌中有功能的氯霉素抗性基因,在其5′端和3′端分別引入BamHI和SacI位點。BglII和SacI消化中間載體pE3,回收大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子片段,與BamHI和SacI消化的擴(kuò)增片段連接轉(zhuǎn)化,在含氯霉素的固體培養(yǎng)基上篩選得到穿梭載體pGJ103,酶切鑒定正確(圖1)。表明擴(kuò)增的700bp的復(fù)制子和氯霉素抗性基因在E.coliDH5α中具有完全的復(fù)制功能。將穿梭載體pGJ103電轉(zhuǎn)化至B.subtilis1A747和DB104,在含氯霉素的轉(zhuǎn)化板上分別挑取單菌落培養(yǎng),提取質(zhì)粒酶切鑒定均正確(圖1),結(jié)果表明構(gòu)建的穿梭載體pGJ103在枯草桿菌中能正常復(fù)制。2.2對外源dna片段的克隆為了確定構(gòu)建的穿梭載體在枯草桿菌中的遺傳穩(wěn)定性,把pGJ103轉(zhuǎn)化到B.subtilis1A747,分別在含氯霉素和不含氯霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)試驗。結(jié)果顯示在含氯霉素的LB培養(yǎng)基中48h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和遺傳不穩(wěn)定;在不含氯霉素的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18h內(nèi)無明顯的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象,酶切鑒定顯示無結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定現(xiàn)象(圖2)。36h培養(yǎng),質(zhì)粒發(fā)生降解現(xiàn)象(圖3)。分別用來自枯草桿菌生物素操縱元的2.4kb,4kb,4.4kb和5kb的片段來驗證pGJ103對外源DNA片段的克隆能力。實驗中3kb以下的片段克隆操作很方便;與較小片段相比,4kb和5kb的2個片段連接效率較低,轉(zhuǎn)化板的克隆子個數(shù)減少,但挑取的克隆子酶切鑒定正確。將克隆了不同大小片段的穿梭載體轉(zhuǎn)化B.subtilis1A747,挑取克隆子過夜培養(yǎng),抽提質(zhì)粒鑒定,結(jié)果正確(圖4)。這說明該穿梭載體對大小不同的DNA片段均具有很好的承載能力。2.3啟動子檢測載體為了驗證啟動子檢測載體功能,將擴(kuò)增的P59啟動子片段,克隆至啟動子檢測載體pGJ199,得到pGJ201。檢測組成型啟動子P59的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度,含pGJ201的B.subtilis1A747培養(yǎng)24h,胞內(nèi)β-半乳糖苷酶酶活性達(dá)到500mU。3帶格朗日系的枯草桿菌端基因型聚合體的構(gòu)建枯草桿菌的分子克隆操作通常效率較低。影響克隆效率的因素主要是兩方面—轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒在宿主中的穩(wěn)定性。因此,構(gòu)建一個方便而穩(wěn)定的穿梭載體是目前最好的解決辦法。本實驗室構(gòu)建的穿梭載體PGJ199,在復(fù)制子的5′端帶有十多個常用的單一酶切位點,這些酶切位點與大腸桿菌復(fù)制功能區(qū)和枯草桿菌的正負(fù)鏈復(fù)制功能區(qū)相互獨立,可以方便地進(jìn)行克隆構(gòu)建。而且,常用的枯草桿菌質(zhì)粒一般缺乏負(fù)鏈復(fù)制功能,在我們的試驗中選擇了在枯草桿菌具有正負(fù)鏈復(fù)制功能的質(zhì)粒pGDV1,PCR擴(kuò)增了正負(fù)鏈復(fù)制子,與中間載體pE3的大腸桿菌復(fù)制子和多克隆位點連接構(gòu)建了僅3.2kb的大腸桿菌-枯草桿菌小型穿梭載體,具有較好的穩(wěn)定性和承載能力。構(gòu)建的穿梭載體pGJ103為我們實驗室的功能基因的表達(dá)以及鳥槍法克隆啟動子片段工作提供了一個方便快捷可靠的克隆工具。在整個穿梭載體的構(gòu)建過程中,pE3的構(gòu)建有一定難度,為了在復(fù)制子的5′端留有充足的酶切位點,選擇