衛(wèi)生毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)編寫：陳秉符古雅2009年3月實(shí)驗(yàn)一毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般操作技術(shù) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)三滅多威經(jīng)口急性毒性試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)四苯經(jīng)呼吸道急性毒性試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)五蓄積毒性試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)六亞慢性和慢性毒性試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)七小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)八小鼠精子畸形試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)九骨髓細(xì)胞染色體畸變分析 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)十鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變試驗(yàn) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)十一致畸試驗(yàn)及胚胎胎仔檢查方法 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)十二網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 錯(cuò)誤!未定義書簽。附錄：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫及注意事項(xiàng) 錯(cuò)誤!未定義書簽。實(shí)驗(yàn)一毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一、目的和意義毒理學(xué)的很多研究工作需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行科研的優(yōu)點(diǎn)是花費(fèi)人力、物力較少，時(shí)間短，易發(fā)現(xiàn)單因素與結(jié)果的關(guān)系，能提供大量有價(jià)值的可與人類生命活動(dòng)現(xiàn)象相類比的資料。在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是保證工作順利進(jìn)行和獲得正確可靠的研究結(jié)果的重要條件。毒理學(xué)研究外源化學(xué)物對于機(jī)體（特別是人體）的有害作用及其機(jī)制。毒理學(xué)研究的主要手段是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型，最終目的是通過外源化學(xué)物對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)，向人（原型）外推，以期評估外源化學(xué)物對人的危害及危險(xiǎn)性。體外實(shí)驗(yàn)主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機(jī)制研究；人體實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查則可進(jìn)一步深化和證實(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所得到的資料。實(shí)際上，毒理學(xué)作為一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)是以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為中心的，毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果觀察和評價(jià)是毒理學(xué)研究的基本方法。通過本次討論，要求學(xué)生基本掌握毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則和方法。二、內(nèi)容（一）毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則和局限性1、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則在毒理學(xué)的試驗(yàn)中，有三個(gè)基本的原則。第一個(gè)原則，化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的作用，可以外推于人。第二個(gè)原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。第三個(gè)原則，成年健康（雄性和雌性未孕）的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。2、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的局限性用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)資料外推到人群接觸的安全性時(shí)，會(huì)有很大的不確定性。（二）毒理學(xué)常規(guī)毒性試驗(yàn)的基本目的毒性評價(jià)或安全性評價(jià)方面的基本目的包括以下幾點(diǎn)：.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。.劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）研究。.確定毒作用的靶器官。.確定損害的可逆性。毒理學(xué)研究還可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感檢測指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機(jī)制研究、受試物的毒物動(dòng)力學(xué)和代謝研究、中毒的解救措施等。對這些要求，應(yīng)擴(kuò)展常規(guī)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)以包括有關(guān)的項(xiàng)目，或者另外設(shè)計(jì)和進(jìn)行靶器官毒理學(xué)研究及機(jī)制毒理學(xué)研究。（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇毒理學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為研究對象的，為獲得可靠的研究結(jié)果，先決條件是正確地選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種的選擇對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種選擇的基本原則是：選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物

種。在毒理學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有地鼠、獼猴、小型豬、雞等。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)見表1-1。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各物種中，實(shí)際上沒有一種完全符合上述物種選擇的原則，目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個(gè)物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。豚鼠常用于皮膚刺激試驗(yàn)和致敏試驗(yàn)，兔常用于皮膚刺激試驗(yàn)和眼刺激試驗(yàn)。遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)多用小鼠，致癌試驗(yàn)常用大鼠和小鼠，致畸試驗(yàn)常用大鼠、小鼠和兔。遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗(yàn)常用母雞。表1-1常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)參數(shù)猴狗貓兔 大 鼠 小鼠豚鼠地鼠成體體重(kg)壽命(a)1615146331水消耗(ml/d)45035032030035614530飼料消耗(成本g/d)1504001001801051210成體代謝cal/kgd)1588080110130600100250體溫(℃)39l438l2呼吸頻率50202553851609083(次/min)(40?60)(10?30)(20?30)(40?65)(65?110)(80?240)(70?100)(35?130)心率(次/min)200100120200328600300450血壓mmHg159/127148/100155/100110/80130/90120/7577/50108/77(收縮/舒張)出生體重(g)500?700110(?22001251005-675?100斷乳時(shí)體重(g)440058003000100?150040?5010?1225035開眼(d)出生當(dāng)天8?128?121010?1211出生當(dāng)天15妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215?2815?164?54?516?194動(dòng)情期(d)1?27?139?19301111窩數(shù)量13?61?61?136?91?121?51?12斷乳年齡(周)16?2466?983?4323?4生殖年齡(月)549106?72?3232生殖期(年)10?155?1041?31131生殖季節(jié)任何時(shí)間春，秋冬季2?3個(gè)月任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間所需面積(tf2)*6833環(huán)境溫度(℃)18?2818?2818?2818?2819?2519?2519?2519?25血容量(ML/Kg)7579605365807585凝血時(shí)間(s)90180120300601460143HCT(%紅細(xì)胞)4245404246414250Hb(g/bl)2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系的選擇品系(strain)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的專用名詞，指用計(jì)劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按遺傳學(xué)控制分類可分為：①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動(dòng)物。如小鼠有津白I、津白H、615,DBA/1和DBA/2,BALB/C,C3H,C57B/6J,A和A/He等。②雜交群動(dòng)物(雜交1代，F(xiàn)1),指兩個(gè)不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物。③封閉群：一個(gè)種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動(dòng)物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動(dòng)物群。如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別，所以毒理學(xué)研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系動(dòng)物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。遺傳毒理學(xué)一般利用嚙齒類動(dòng)物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。有的文獻(xiàn)報(bào)告在小鼠骨髓微核試驗(yàn)MS/Ae品系比ddy,CD-1或BDF品系更敏感。但一般認(rèn)為還沒能證明某一品系對所有的遺傳毒性物質(zhì)比其他品系都敏感。在致癌試驗(yàn)中對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系有一定的要求，特別重視有關(guān)病理損害的自發(fā)發(fā)生率。3、對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物控制的選擇按微生物控制分類，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四級，見表1-2。對于毒性試驗(yàn)及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動(dòng)物，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。表1-2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級級別 要 求I級 普通動(dòng)物，應(yīng)沒有傳染給人的疾病II級 清潔動(dòng)物，除I級標(biāo)準(zhǔn)外，種系清楚，沒有該動(dòng)物特有的疾病III級 無特定病原體動(dòng)物(SPF),除I級標(biāo)準(zhǔn)外，動(dòng)物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖，在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，可有不致病細(xì)菌叢，沒有致病病原體IV級 無菌動(dòng)物，在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動(dòng)物，動(dòng)物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(包括絕大部分病毒)4、個(gè)體選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對外來化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個(gè)體差異，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體選擇。.性別同一物種、同一品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄兩性通常對相同外源化學(xué)物毒性反應(yīng)類似但雌雄兩性對化學(xué)物的毒性敏感性上存在著差別。如果已知不同性別的動(dòng)物對受試物敏感性不同，應(yīng)選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則應(yīng)選用雌雄兩種性別。如實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應(yīng)將不同性別動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)分析。在遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)中，對性別的選擇有幾種意見：①對單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別。②對單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別，除非已在一個(gè)性別得到陽性反應(yīng)，就不必對另一種性別進(jìn)行試驗(yàn)。③對單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別，除非經(jīng)毒代動(dòng)力學(xué)研究證明受試物和其代謝產(chǎn)物)在雄性和雌性無差別和/或如果在確定劑量的預(yù)試驗(yàn)證明有相等毒性。此假定在非遺傳毒性與遺傳毒性之間有相關(guān)。④對單個(gè)物種常規(guī)用一種性另IJ(雄性或雌性)，除非預(yù)期/證明存在性別差異。由于歷史的原因UDS體內(nèi)/體外試驗(yàn)常規(guī)用雄性大鼠。一般來說，對于初次試驗(yàn)的受試物，應(yīng)該采用兩種性別。對大鼠和小鼠各一種性別進(jìn)行試驗(yàn)可能比單個(gè)物種兩種性別提供更好的危害鑒定，但這需要更多的資料來證明。.年齡和體重.生理狀態(tài).健康狀況（四）毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)1、體內(nèi)試驗(yàn)設(shè)計(jì).劑量分組在毒理學(xué)試驗(yàn)中，最重要的就是研究劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，也就是當(dāng)外源化學(xué)物染毒劑量增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)（效應(yīng)）隨之而增強(qiáng)。劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系的存在是確定外源化學(xué)物與有害作用的因果關(guān)系的重要依據(jù)，也可證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。因此，在毒理學(xué)試驗(yàn)中，一般至少要設(shè)3個(gè)劑量組（即高劑量組、中劑量組、低劑量組），希望能得到滿意的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系。特別注意設(shè)立對照組：未處理對照組（以前有稱為空白對照組）：陰性（溶劑/賦形劑）對照：③陽性對照：④歷史性對照：.各組動(dòng)物數(shù).試驗(yàn)期限2、體外試驗(yàn)設(shè)計(jì).測定受試物溶解性.試驗(yàn)最高劑量的推薦.代謝活化.陽性對照.重復(fù)（五）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的染毒和處置1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備2、受試物和樣品的準(zhǔn)備3、染毒途徑4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死及生物標(biāo)本采集.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死方法.血液采集.尿液采集.病理解剖、標(biāo)本留取和組織病理學(xué)檢查（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理和分析在毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施中應(yīng)貫徹實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的對照、隨機(jī)和重復(fù)的原則，實(shí)驗(yàn)的各劑量組所得到的結(jié)果應(yīng)與陰性對照組比較。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（指標(biāo)）的變量類型是數(shù)值變量（計(jì)量資料）還是分類變量（計(jì)數(shù)資料），選用不同的統(tǒng)計(jì)分析方法。在評價(jià)毒理學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果時(shí)，應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的假設(shè)是關(guān)于總體特征的假設(shè)，檢驗(yàn)方法是以統(tǒng)計(jì)量的抽樣分布為根據(jù)的，得到的結(jié)論是概率性的，不是絕對的肯定或否定，不等同于有或無生物學(xué)意義。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出科學(xué)的判斷和解釋，應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果、生物學(xué)知識和經(jīng)驗(yàn)。1、毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)及方法在毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果評價(jià)中起關(guān)鍵的作用，毒理學(xué)試驗(yàn)的發(fā)展也促進(jìn)了生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的發(fā)展。毒理學(xué)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)的主要進(jìn)展是劑量一反應(yīng)關(guān)系研究和對超離差數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。1).毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循隨機(jī)、重復(fù)及對照三個(gè)原則，要求各觀察值具有代表性，并且是相互獨(dú)立的。毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)具體涉及到劑量水平數(shù)目及間隔，每個(gè)劑量點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)單位數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)單位接種及計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)，對照組的設(shè)置等。實(shí)驗(yàn)單位的確定對于樣品的獨(dú)立性是很重要的，實(shí)驗(yàn)單位(experimentalunit)是進(jìn)行處理時(shí)或觀察時(shí)獨(dú)立的最大采樣單位。以動(dòng)物和培養(yǎng)物作為實(shí)驗(yàn)單位要比以細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)單位更為可取。此外，如果同時(shí)評價(jià)幾個(gè)不同因素的效應(yīng)，應(yīng)注意均衡的原則，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)可以區(qū)分不同因素的貢獻(xiàn)并分別估計(jì)。樣本的代表性要求具有同質(zhì)性，即各處理組和對照組的非實(shí)驗(yàn)因素的條件均一致，為此，各實(shí)驗(yàn)單位(動(dòng)物或培養(yǎng)物)的分組及整個(gè)實(shí)驗(yàn)的全部操作都應(yīng)遵循隨機(jī)化原則。在利用形態(tài)學(xué)指標(biāo)的毒理學(xué)試驗(yàn)，必須采用盲法觀察結(jié)果，以消除實(shí)驗(yàn)者觀察結(jié)果的偏性。樣本應(yīng)有足夠的大小和適當(dāng)?shù)闹貜?fù)次數(shù)，以估計(jì)處理之間、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的變異性。一般可根據(jù)顯著性水準(zhǔn)、檢驗(yàn)把握度、容許誤差、總體標(biāo)準(zhǔn)差等來估計(jì)樣本的大小。嚴(yán)格執(zhí)行毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的上述要求，才可能得到可靠性和重復(fù)性良好的結(jié)果，也是進(jìn)行正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)的基礎(chǔ)。良好的質(zhì)量保證和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以監(jiān)控系統(tǒng)誤差，而統(tǒng)計(jì)處理則用來確定隨機(jī)誤差。毒理學(xué)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)通常是由劑量水平和相應(yīng)觀察值組成的二維關(guān)系型數(shù)據(jù)。毒理學(xué)試驗(yàn)處理組與陰性對照組觀察值均數(shù)的比較，如果資料可擬合某種分布，則適用于參數(shù)檢驗(yàn)，其敏感度和效率高于非參數(shù)檢驗(yàn)；如資料不能擬合某些已知的分布，則應(yīng)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，以滿足正態(tài)性和方差齊性。如果任何變換都不能改善數(shù)據(jù)的分布，可能存在個(gè)別可疑值，應(yīng)予以識別和剔除。另一方面，可使用不依賴總體分布模型的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。一種毒理學(xué)試驗(yàn)資料可以有若干種正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，但可能不存在唯一正確的方法。其原因主要是表面上不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法常以相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)概念和模型為基礎(chǔ)。另一方面，利用不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來評價(jià)毒理學(xué)試驗(yàn)資料缺乏比較研究。.各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個(gè)處理組與陰性對照組比較各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個(gè)處理組與陰性對照組比較常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法見表1-3。表1-3各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個(gè)比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法類型連續(xù)性數(shù)據(jù)，方差齊正態(tài)分布方差不齊離散性數(shù)據(jù)分布未知二項(xiàng)分布泊松分布處理組與陰卡方檢驗(yàn)，F(xiàn)isheru檢驗(yàn)非參數(shù)法，如性對照組兩t檢驗(yàn)t/檢驗(yàn)確切概率法，u檢Wilcoxon秩和兩比較驗(yàn)檢驗(yàn)多個(gè)處理組與陰性對照組比較Dunnett檢驗(yàn)(1955)改進(jìn)的DUNnett檢驗(yàn)(1980)平方根反正弦轉(zhuǎn)換，再用dunnett檢驗(yàn)，或者Simes法(1986)Suissa和Salmi法(1989)非參數(shù)法，如多重比較秩和檢驗(yàn)(Steel，1959).劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容。在急性毒性化與0)研究中，就是典型的劑量-反應(yīng)關(guān)系研究，ld50是統(tǒng)計(jì)學(xué)的點(diǎn)值估計(jì)和區(qū)間估計(jì)。在其他毒理學(xué)試驗(yàn)中的陽性劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)的確定也應(yīng)通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和判定，盡管，可以用各處理組與陰性對照組兩兩比較和各處理組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)高劑量組與中、低劑量組及對照組間差別有顯著性，中劑量組與低劑量組和對照組間差別有顯著性，低劑量組與對照組間差別無顯著性，來證明有劑量-反應(yīng)關(guān)系；但這種方法的效率較低。劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)的判定可以分為定性和定量統(tǒng)計(jì)學(xué)兩大類。劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)定性分析即為趨勢檢驗(yàn)，而統(tǒng)計(jì)學(xué)定量分析則為模型擬合。趨勢檢驗(yàn)是檢驗(yàn)對自變量“規(guī)定的水平，反應(yīng)的觀察值增高或降低的趨勢的顯著性。當(dāng)自變量s為定量數(shù)據(jù)時(shí)，則可進(jìn)行模型擬合，即劑量反應(yīng)關(guān)系的定量研究。趨勢試驗(yàn)(trendtesting),劑量為xi；反應(yīng)為巴，當(dāng)有x0<x1<???<xK，無效假設(shè)為H0：u=u0=...=uk備擇假設(shè)為Ha：巴W%W…?乙或巴三乙三…三八單調(diào)上升或單調(diào)下降趨勢。如反應(yīng)巴為連續(xù)資料服從正態(tài)分布，當(dāng)xi為定量數(shù)據(jù)，則可選用簡單的線性回歸或加權(quán)線性回歸；如反應(yīng)巴為離散資料服從二項(xiàng)分布或泊松分布，可選用Cochran-Armitage趨勢檢驗(yàn)；如果樣本所屬的總體分布未知，則可利用非參數(shù)法加Jonckheere-Terstra趨勢檢驗(yàn)(Jonckheere,1954)。在毒理學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法中最主要的發(fā)展是劑量-反應(yīng)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、超離差(overdispersion)計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及廣義線性模型(generalizedlinearmodel)。這些方法，可以利用統(tǒng)計(jì)程序包如SAS,Genstat等來實(shí)現(xiàn)。.對常規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)資料推薦的統(tǒng)計(jì)學(xué)方^Cad等，1994)A體重和器官重量：體重常是毒性效應(yīng)最敏感的指標(biāo)之一。如果每組樣品量足夠大(10或10個(gè)以上)，可用下述方法：器官重量計(jì)算為體重的百分比。按體重或體重改變分析。如在試驗(yàn)開始，動(dòng)物隨機(jī)化分組(各組體重均數(shù)差別無顯著性，各組所有的動(dòng)物體重在總平均體重的2個(gè)SD之內(nèi))，利用體重改變分析比較好。對各組資料利用Bartlett方差齊性試驗(yàn)，檢測方差齊性。根據(jù)方差齊性或不齊，決定進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。如果樣本量較小，可利用Kruskal-Wal?E參數(shù)檢測。B臨床化學(xué)：過去一般用t檢驗(yàn)或ANOVA,但并非是最適當(dāng)?shù)姆椒?。因?yàn)檫@些生化參數(shù)很少是彼此獨(dú)立的。通常，所研究的并不是單獨(dú)某一個(gè)參數(shù)，而是與靶器官毒作用有關(guān)的一組參數(shù)，如CPK,HBDH和LDH同時(shí)增高強(qiáng)烈指示心肌損害。這時(shí)我們并不只是注意其中一個(gè)參數(shù)的增高，而是全部3個(gè)參數(shù)。而血清電解質(zhì)(如鈉、鉀、鈣)常相互影響，一種降低常伴另一種增加。而且資料的性質(zhì)，由于這些參數(shù)的生物學(xué)性質(zhì)或測定的方法，常不服從正態(tài)分布(為偏態(tài)分布)或?yàn)榉沁B續(xù)的，如肌昔、鈉、鉀、氯、鈣和血尿素氮。臨床化學(xué)資料適用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：①ANOVA,Bartlett檢驗(yàn)和/或F檢驗(yàn)，t-檢驗(yàn)，適用于：鈣、葡萄糖、BUN、肌苷、膽堿脂酶、總蛋白、白蛋白、HBDH、ALP、CPK、LDH、ALT、AST及血紅蛋白。②Kruskal-Wallis非參數(shù)ANOVA適用于：總膽紅素、GGT。C血液學(xué)：不同物種、品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液學(xué)檢查的數(shù)據(jù)，所服從的分布也可能是不同的。這些參數(shù)的大部分是相互有關(guān)的，并依賴于所用的測定方法。RBC數(shù)、血小板數(shù)和MCV可用儀器測定，數(shù)據(jù)適用于參數(shù)檢驗(yàn)。紅細(xì)胞壓積(HCT)是由RBC和MCV得到的計(jì)算值，故依賴于此兩個(gè)參數(shù)；但如直接測定，也可用參數(shù)檢驗(yàn)。血紅蛋白是直接測定的并是獨(dú)立的連續(xù)數(shù)據(jù)。但如同時(shí)存在血紅蛋白的多種形態(tài)(氧血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白等)，則可能不是典型的正態(tài)分布，而呈多模型分布。此時(shí)可用wilcoxon檢驗(yàn)或多重秩和檢驗(yàn)。WBC總數(shù)服從正態(tài)分布，并適用于參數(shù)檢驗(yàn)。而WBC的分類或報(bào)告為百分比或乘以WBC總數(shù)得“絕對〃分類WBC數(shù)。這些資料，特別是嗜酸性粒細(xì)胞不符合正態(tài)分布，應(yīng)該用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)。應(yīng)注意,單個(gè)參數(shù)的變化很少有生物學(xué)意義,因?yàn)檫@些參數(shù)是相互有關(guān)的,應(yīng)注意發(fā)現(xiàn)并分析預(yù)期的參數(shù)變化譜。D組織病理學(xué)損害發(fā)生率：在亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)，強(qiáng)調(diào)了組織病理學(xué)檢查。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是評價(jià)處理組動(dòng)物組織病理學(xué)損害發(fā)生率是否高于對照組動(dòng)物。除了癌發(fā)生率外，也應(yīng)注重發(fā)現(xiàn)其他病理損害。在處理組和對照組動(dòng)物病理損害發(fā)生率比較常用卡方檢驗(yàn)或金卜0律青確檢驗(yàn)。利用雙側(cè)檢驗(yàn)還是單側(cè)檢驗(yàn)取決于研究者的要求。對于多重比較可用Bonferroni法，而且可利用趨勢檢驗(yàn)來評價(jià)劑量-反應(yīng)關(guān)系。E生殖毒性：對生殖毒性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，是以窩或妊娠雌性動(dòng)物）為實(shí)驗(yàn)單位，而不是幼體。生殖毒性試驗(yàn)一般可得4個(gè)變量：生育力指數(shù)（FI）、受孕指數(shù)（GI）、存活力指數(shù)（VI）和哺育指數(shù)（LI）。對這些變量，如樣本數(shù)為10或10以上可利用Wilcoxon-Mann-whitneyU檢驗(yàn)或KrusKal-Wallis非參數(shù)ANOVA。如樣本數(shù)小于10，則可用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（用于2組比較）或Aruskal-wallis非參數(shù)ANOVA（用于3組或3組以上的比較）。F致畸試驗(yàn)：每組應(yīng)有20只妊娠動(dòng)物。并且，實(shí)驗(yàn)單位為窩，而不是胎體。如樣本數(shù)為10或10以上，可近似為正態(tài)，利用參數(shù)檢驗(yàn)（如卡方檢驗(yàn)、t-檢驗(yàn)或ANOVA）、來評價(jià)結(jié)果。當(dāng)樣本數(shù)小于10，可用非參數(shù)檢驗(yàn)（Wilcoxon秩和檢驗(yàn)或Kruskal-wallis非參數(shù)ANOVA）。此外，Wilcoxon-Mann-whitneyU檢驗(yàn)也廣泛用于致畸試驗(yàn)。G飼料和染毒柜中受試物濃度分析：當(dāng)受試物摻入飼料進(jìn)行喂飼試驗(yàn)，或?yàn)闅馊苣z吸入試驗(yàn)，應(yīng)定期測定飼料中受試物濃度和染毒柜中受試物氣溶膠的濃度。采樣應(yīng)隨機(jī)并有代表性。一般要求飼料或空氣中濃度應(yīng)在預(yù)定濃度的±10%之內(nèi)；顯著增高的峰濃度可能超過代謝或修復(fù)系統(tǒng)能力，出現(xiàn)急性毒作用。如果不了解飼料/空氣中真實(shí)的暴露水平，可能錯(cuò)誤地解釋該受試物的低水平慢性毒性。氣溶膠顆粒直徑分級采樣可能得到分類資料如＞100um,100?25um,25?10um,10?3um等），這種資料應(yīng)該用幾何均數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)差來描述。H致突變性試驗(yàn)：絕大多數(shù)遺傳毒理學(xué)短期試驗(yàn)（STT）的觀察值為計(jì)數(shù)資料（如突變體數(shù)、畸變數(shù)、SCE數(shù)）或是相對數(shù)（如存活細(xì)胞的突變頻率），因此STT結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)主要是對離散性資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷。最常用的遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：a）Ames試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)：Ames試驗(yàn)的結(jié)果每平板回變菌落數(shù)的分布不完全服從泊松分析，有超離差現(xiàn)象；并且，其劑量反應(yīng)曲線呈先上升后下降的傘形。Ames等l975年提出2倍判斷標(biāo)準(zhǔn)，在1983年改進(jìn)的方法中已不再推薦。2倍判斷標(biāo)準(zhǔn)有較大的缺點(diǎn)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)不是統(tǒng)計(jì)學(xué)判斷，對自發(fā)回變率較高的菌株偏嚴(yán)，而對自發(fā)回變率較低的菌株偏松。已發(fā)展了幾種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用于Ames試驗(yàn)的假設(shè)檢驗(yàn)和劑量反應(yīng)研究。Kim和Margolin等（1999）利用基于生物學(xué)的機(jī)制模型，發(fā)展YSALM程序，用于Ames試驗(yàn)結(jié)果的判斷。b）遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)：（包括微核試驗(yàn)、染色體畸變試驗(yàn)和顯性致死試驗(yàn)）的統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)：Adler等（1998）提出了3步法。①確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可接受。如果同時(shí)進(jìn)行的陰性對照的均數(shù)在歷史性對照的均數(shù)±3SD之內(nèi)，則該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以接受。如果不接受，則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。②劑量-反應(yīng)分析。利用同時(shí)進(jìn)行的陰性對照資料進(jìn)行劑量反應(yīng)趨勢檢驗(yàn)。有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的陽性趨勢表明受試物處理的效應(yīng)。③評價(jià)各個(gè)處理組反應(yīng)，然后將各個(gè)處理組的均數(shù)分別與歷史性陰性對照比較，如各個(gè)處理組均未顯示差別顯著性，但趨勢檢驗(yàn)有顯著性意義，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋需要生物學(xué)判斷。如果趨勢無顯著性，但經(jīng)多重比較校正后僅一個(gè)處理組與歷史性陰性對照比較差別有顯著性（SimesRJ.Biometricsl986；73：751-754）,則此試驗(yàn)結(jié)果的解釋也需要生物學(xué)判斷。這時(shí)，可認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為可疑。同時(shí)陰性對照與歷史性對照 -重新試驗(yàn)（均數(shù)±3SD）比較 在范圍之外I在范圍之內(nèi)用同時(shí)陰性對照進(jìn)行趨勢檢驗(yàn)有顯著性I I無顯著性各處理組與歷史、 /各處理組與歷史性陰性對照比較性陰性對照比較有顯著性I 無顯著性I有顯著性 I有顯著性陽性 可疑 陰性圖5-2遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)的程序。I行為毒理學(xué)：行為毒理學(xué)試驗(yàn)一般得到4種類型的資料：①觀察的記分值，來自開闊場試驗(yàn)等；②反應(yīng)率，來自舔液，總活動(dòng)或壓桿；③錯(cuò)誤率，來自學(xué)習(xí)-記憶試驗(yàn)④到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間。對這些數(shù)據(jù)常用的和推薦的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法見表1-4。行為發(fā)育毒性和生殖毒性研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法也見表1-4,在斷乳前應(yīng)以窩為實(shí)驗(yàn)單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。表1-4行為毒理學(xué)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（Gad等，1994）觀察類型常用的方法推薦的方法觀察記分值t檢驗(yàn)或單例ANOVAKruskal-Wallis非參數(shù)ANOVA或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)反應(yīng)率t檢驗(yàn)或單側(cè)ANOVAKruskal—wallisANOVA或一側(cè)ANOVA錯(cuò)誤率ANOVA檢驗(yàn)，再進(jìn)行Posthoc檢驗(yàn)Fisher精確檢驗(yàn)或RXC卡方，Mann—WhitneyU檢驗(yàn)到達(dá)終點(diǎn)時(shí)間t檢驗(yàn)或一側(cè)ANOVAANOVA檢驗(yàn)再進(jìn)行Posthoc檢驗(yàn)或Kruskal-WallisANOVAA行為發(fā)育或生殖試驗(yàn)ANOVA檢驗(yàn)，再分別進(jìn)行檢驗(yàn)Fisher精確檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis非參數(shù)AN0VA或Mann-WhitueyU檢驗(yàn)2、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義在評價(jià)毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，要綜合評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義。一般來說，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是具有生物學(xué)意義的必要條件之一。正確地利用統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)的結(jié)果有助于確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。在判斷生物學(xué)意義即生物學(xué)重要性）時(shí)，可考慮以下步驟。（1）縱向比較：此參數(shù)的改變有無劑量-反應(yīng)關(guān)系?；瘜W(xué)物毒作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)研究的基本假設(shè)。當(dāng)某參數(shù)的改變存在陽性劑量-反應(yīng)關(guān)系，就可認(rèn)為此參數(shù)的改變與受試物染毒有關(guān)，具有生物學(xué)意義。⑵橫向比較：此參數(shù)的改變是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變。例如，生化參數(shù)很少是彼此獨(dú)立的，單個(gè)劑量組的一個(gè)參數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的改變一般不認(rèn)為有生物學(xué)意義，除非此改變?yōu)槠渌麉?shù)改變所支持。如沒有骨髓或脾組織學(xué)改變或沒有高鐵血紅蛋白生成，則單有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變是沒有生物學(xué)意義的。同樣，在免疫毒理學(xué)中，單有淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變不伴有淋巴結(jié)組織學(xué)改變也可能是沒有生物學(xué)意義的。（3）與歷史性對照比較：由于目前尚無公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物參考'正?！ㄖ?，應(yīng)由本實(shí)驗(yàn)室利用相同品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和相同的溶劑，進(jìn)行至少10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的陰性（溶劑）對照的資料構(gòu)成，以其均值±1.96X標(biāo)準(zhǔn)誤作為參考值的范圍。同時(shí)進(jìn)行的陰性對照應(yīng)在歷史性對照的均數(shù)±3SD范圍之內(nèi)，否則應(yīng)重新試驗(yàn)。另有認(rèn)為，凡某種觀察值與對照組比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜，并符合下列情況之一者，即可認(rèn)為已偏離正常參考值范圍，屬于有害作用。①其數(shù)值不在正常參考值范圍之內(nèi)；②其數(shù)值在正常參考值范圍之內(nèi)，但在停止接觸后，此種差異仍持續(xù)一段時(shí)間；③其數(shù)值在正常參考值范圍之內(nèi)，但如機(jī)體處于功能或生化應(yīng)激狀態(tài)下，此種差異更加明顯。應(yīng)該指出，后兩種情況需要附加的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。另外，還有一些其他的考慮。如處理組同時(shí)與對照組兩組均數(shù)之差值應(yīng)超過檢測誤差的兩倍以上。某些血液生化指標(biāo)（如AST、ALT等）的測定值升高才有生物學(xué)意義。當(dāng)處理組數(shù)據(jù)與陰性對照組比較差別有顯著性，并且經(jīng)分析認(rèn)為是與處理有關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步判斷其為有害效應(yīng)還是非有害效應(yīng)。決定一種效應(yīng)是否為有害作用需要專家的判斷。不同指標(biāo)或參數(shù)的生物學(xué)意義和重要性是不同的。在分析和綜合評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義時(shí)，可能遇到四種情況，見表1-5。在此表中，第I和第W種情況最為常見，第I種情況是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義也無生物學(xué)意義，第W種情況是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義也有生物學(xué)意義。但是有時(shí)在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中會(huì)出現(xiàn)第n和第m種情況。表1-5毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義生物學(xué)意義無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義有無Im有nW第m種情況是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但無生物學(xué)意義，例如在某個(gè)亞慢性毒性試驗(yàn)中，中劑量組動(dòng)物血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于陰性對照組，差別有顯著性（p<,而高劑量組和低劑量組動(dòng)物血白細(xì)胞計(jì)數(shù)與陰性對照組比較差別無顯著性（p>。由于在此實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未出現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，因此中劑量組血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低可能是由于偶然因素造成的，沒有生物學(xué)意義。但是，如果僅在高劑量組動(dòng)物血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，與陰性對照組比較差別有顯著性（p<）時(shí)，必須仔細(xì)地核實(shí)高劑量組的資料。如果資料無任何疑問，可認(rèn)為此變化可能具有生物學(xué)意義。最好是重新進(jìn)行一個(gè)亞慢性毒性試驗(yàn)，并加大受試物的劑量，如果能夠觀察到劑量-反應(yīng)關(guān)系，則說明此劑量組血白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低是有生物學(xué)意義的；如果加大受試物劑量沒有觀察到劑量-反應(yīng)關(guān)系，才可以說此劑量組血白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低沒有生物學(xué)意義。因此，在判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義時(shí)，有無劑量-反應(yīng)關(guān)系是關(guān)鍵。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但無生物學(xué)意義的情況，更常見的是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施不良所致。第n種情況是具有生物學(xué)意義但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)樵撌录陌l(fā)生是極端罕見的，例如在哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)中，在染毒組中出現(xiàn)對照組中沒有的腫瘤類型，盡管從統(tǒng)計(jì)學(xué)上此種腫瘤的發(fā)生率很低，與對照組比較差別無顯著性（p>,但還應(yīng)該認(rèn)為是有生物學(xué)意義的。利用一種以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，當(dāng)某種效應(yīng)在一個(gè)物種出現(xiàn)而在另一物種不出現(xiàn)，或一個(gè)物種遠(yuǎn)比另一物種敏感時(shí)，則使結(jié)果的解釋復(fù)雜化，難以確定以哪個(gè)物種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人最為合適。除非有足夠的資料（通常是比較毒動(dòng)學(xué)或毒效學(xué)資料）可以表明最合適的物種，一般是以最敏感的物種來確定NOAEL和安全限值。以上我們討論了毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，介紹了對外源化學(xué)物進(jìn)行毒性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果分析等各個(gè)環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制是保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有科學(xué)性、準(zhǔn)確性和公正性的先決條件。沒有質(zhì)量保證，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性是無法肯定的。我們在安全性毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、總結(jié)報(bào)告的各個(gè)環(huán)節(jié)上，應(yīng)該自覺、主動(dòng)地遵循GLP原則，逐步從人員的組成和職責(zé)、設(shè)施、設(shè)備、質(zhì)量保證部門QAU）、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、受試品與對照品、實(shí)施方案、實(shí)驗(yàn)記錄和總結(jié)報(bào)告等各個(gè)方面落實(shí)GLP。實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般操作技術(shù)一、目的和意義毒理學(xué)研究需要用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)，通過對動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)觀察和分析來研究毒作用，獲得毒物的毒性、劑量一反應(yīng)關(guān)系、毒作用機(jī)制等方面的資料，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是毒理學(xué)研究中重要的手段之一。通過本次實(shí)習(xí)學(xué)習(xí)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本操作技術(shù)，掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、動(dòng)物抓取、染毒方法和生物材料的采集等技術(shù)。二、內(nèi)容（一）健康動(dòng)物的選擇無論選擇哪種種屬品系的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均要求選擇健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康動(dòng)物檢查時(shí)要求達(dá)到：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動(dòng)迅速，反應(yīng)靈活，食欲及營養(yǎng)狀況良好。選擇時(shí)重點(diǎn)檢查以下項(xiàng)目：.眼睛明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無分泌物。.耳耳道五分泌物溢出，耳殼無膿瘡。.鼻無噴嚏，無漿性粘液分泌物。.皮膚無創(chuàng)傷、無膿瘡、疥癬、濕疹。.頸部要求頸項(xiàng)端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應(yīng)選作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。6,消化道無嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。.神經(jīng)系統(tǒng)無震顫、麻痹。若動(dòng)物（大鼠、小鼠）出現(xiàn)圓圈動(dòng)作或提尾倒置呈圓圈擺動(dòng)，應(yīng)放棄該動(dòng)物。.四肢及尾四肢、趾及尾無紅腫及潰瘍。（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別鑒定動(dòng)物性別不同對毒物的敏感性也不同，這可能與性激素、肝微粒體羥基化反應(yīng)有關(guān)，也隨受試物而異。因此，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇性別，一般實(shí)驗(yàn)如對性別無特殊要求者，宜選用雌雄動(dòng)物各半。.大鼠、小鼠主要依肛門與生殖器孔間的距離加以區(qū)分。間距大者為雄性，小者為雌性。雌性生殖器與肛門之間有一無毛小溝，距離較近。雄性可見明顯的陰囊，生殖器突起較雌鼠大肛門和生殖器之間長毛。另外成年雄性臥位可見到睪丸雌性在腹部可見乳頭。圖2-1雌雄動(dòng)物肛門與外生殖器間距離

.豚鼠用一只手抓住豚鼠頸部，另一只手扒開靠生殖器孔的皮膚，雄性動(dòng)物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動(dòng)物則顯出三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個(gè)乳頭。.家兔將家兔頭輕輕夾在實(shí)驗(yàn)者左腋窩下，左手按住腰背部，右手拉開尾巴并將尾巴夾在中指和無名指中間，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮膚扒開。雄兔即可見到一圓孔中露出圓錐形稍向下彎曲的陰莖（但幼年雄兔看不到明顯的陰莖，只能看到圓孔中有凸起物，即是陰莖）。雌兔此處則為一條朝向尾巴的長縫，呈橢圓形的間隙，間隙越向下越窄，此即為陰道開口處。雄性圖2-2 兔雌雄生殖器外型特征與差異（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抓取方法正確地抓取固定動(dòng)物，是為了在不損害動(dòng)物健康、不影響觀察指標(biāo)、并防止被動(dòng)物咬傷的前提下，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。.小鼠的抓取方法首先用右手從籠盒內(nèi)抓取鼠尾提起，注意不可抓尾尖（見圖A）,放在鼠籠蓋或?qū)嶒?yàn)臺上向后拉（見圖B）,在其向前爬行時(shí)，迅速用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚（見圖C）,將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（見圖D）。

D圖2-3小鼠的抓取.大鼠的抓取方法大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中，這樣右手可進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作。A B圖2-4大鼠的抓取

3.豚鼠的抓取方法豚鼠膽小易驚，在抓取時(shí)要穩(wěn)、準(zhǔn)、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，

抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部（見圖A）,另一只手托住臀部即可（見圖B）。A B圖2-5豚鼠的抓取4.兔的抓取方法用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。圖2-6兔的抓?。ㄋ模?shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重、編號、標(biāo)記方法.稱重大、小鼠秤的感應(yīng)量需在0.1g以下。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，選擇一定數(shù)量的大、小鼠，體重要求在同一組內(nèi)、同性別動(dòng)物體重差異應(yīng)小于平均體重的10%,不同組間同性別動(dòng)物體重均值差異應(yīng)小于5%。.編號動(dòng)物編號方法有多種。大、小鼠常用方法如下：（1）染色法：染色法是用化學(xué)劑在動(dòng)物身體明顯部位如皮毛、四肢等處進(jìn)行涂染，或用不同顏色等來區(qū)別各組動(dòng)物，是實(shí)驗(yàn)室最常用、最容易掌握的方法。常用的標(biāo)記液有苦味酸酒精飽和溶液（黃色）。標(biāo)記時(shí)，用標(biāo)記筆 取上述溶液，在動(dòng)物體表不同部位涂上斑點(diǎn)，以示不同號碼。一般把涂在右前肢上的記為1號，按順時(shí)針方向，依次右后肢為2號，左后肢為3號，左前肢為4號，頭部為5號（見圖2-7A）,6-10則由以上5個(gè)基本數(shù)復(fù)合而成，比如6號則是在頭部和右前肢標(biāo)記各一（見圖2-7B）,7號為在頭部和右后肢體標(biāo)記一，以此類推。在動(dòng)物的背部劃一長條為10號。10號以上均由上述復(fù)合方法進(jìn)行編號。例如：16號是在頭部、右前肢、背部均有標(biāo)記（見圖2-7C）。

圖2-7A 圖2-7B 圖2-7C⑵剪耳法：在耳朵不同部位剪一小孔代表某個(gè)號碼。常以右耳代表個(gè)位，左耳代表十位?；蚺c染色法配合使用，右耳剪孔代表十位。圖2-8小動(dòng)物剪耳法標(biāo)記號碼⑶烙印法：是用刺數(shù)鉗在動(dòng)物耳上刺上號碼，然后用棉簽蘸著溶在酒精中的黑墨在刺號上加以涂抹，烙印前最好對烙印部位預(yù)先用酒精消毒。⑷號牌法：用金屬的牌號固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳上，大動(dòng)物可系于頸上。（五）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組方法為了得到客觀的劑量一反應(yīng)關(guān)系，應(yīng)將一群動(dòng)物按統(tǒng)計(jì)學(xué)原則隨機(jī)分配到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中。可按隨數(shù)字表方法進(jìn)行隨機(jī)分組（見隨機(jī)數(shù)字表方法分組說明）。但小動(dòng)物的年齡和體重呈正相關(guān)，而年齡又與毒物代謝動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)。為了減少實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物間的體重差異，在實(shí)際工作中常采用體重均衡法（簡化分層隨機(jī)法）進(jìn)行分組，即將同一性別的動(dòng)物按體重大小順序排列，分組時(shí)由體重小的到大的，依次隨機(jī)分配到各組。一種性別的動(dòng)物分完以后，再分配另一種性別的動(dòng)物。各組雌雄性動(dòng)物的數(shù)目應(yīng)盡可能相等。體重均衡法分配方法如下：第一步將動(dòng)物按體重分組以急性毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)使用小鼠為例，一般按照18?g,19?g,20?g,21?g,22?g,23?g,24?g分為7組，所有動(dòng)物稱重后放入相應(yīng)的體重組中。

第二步將同一體重段的動(dòng)物均勻分配至各試驗(yàn)組中從最低體重組中隨意取出一只動(dòng)物放入實(shí)驗(yàn)組第一組，第二只動(dòng)物放入第二組，以此類推，直到該組動(dòng)物用完。再從下一體重組中隨意取出動(dòng)物，依次放入各實(shí)驗(yàn)組直至實(shí)驗(yàn)各組均得到一只動(dòng)物。如此反復(fù)循環(huán)操作，將所有動(dòng)物分完為止，結(jié)果會(huì)使體重相近的動(dòng)物被均勻分布到各實(shí)驗(yàn)組中。隨機(jī)數(shù)字表方法分組說明：例如：設(shè)將30只雄性動(dòng)物平均分成A、B、C、D、E、F六組，每組5只動(dòng)物。將巳編號的動(dòng)物以號碼按隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分配。如選隨機(jī)數(shù)字表第二行，從第一個(gè)數(shù)字開始，順次抄下30個(gè)數(shù)字（可依橫行、豎行或斜行抄錄）。將每個(gè)數(shù)字一律除以6（組數(shù)），根據(jù)余數(shù)1、2、3、4、5、0（整除者）分別將動(dòng)物分配到A、B、C、D、E、F組，結(jié)果見表1（數(shù)字源見第二行駛隨機(jī)數(shù)字表）0347437386977424解6215,766227660347437386977424解6215,766227661?568599265559563564369647366142811457漪56502671079696SS27313854824G469663 62■12三3323732329079785305037295153162430990S32GE86045073G075113553858595712101421OG1844眈53CO11U1095246179S9738B9754U1088264931762383Oil3030表2-1 動(dòng)物隨機(jī)分組表動(dòng)物號1234 56 78 9101112 131415隨機(jī)數(shù)字除6余數(shù)2分組B971A742B240F67 6212AB428103FC145723BC20422B53 3205FE372B321A動(dòng)物號16171819 2021222324252627 282930隨機(jī)數(shù)字除6余數(shù)分組F273C71A3607 5113FA245103CF798915CA731E164A76 6242DD273B660C按上法分組后，A組有動(dòng)物7只，B組7只，C組6只，D組與E組各2只，F(xiàn)組6只。為了使每組動(dòng)物數(shù)均為5只，需要根據(jù)隨機(jī)分配的原則再選出2只A組和1只C組動(dòng)物給D組。B組選出2只，F(xiàn)組選出1只給E組。具體方法如下：繼續(xù)抄下隨機(jī)數(shù)字分別除以A、B、C、F組的動(dòng)物數(shù)，既56/7（7為A組動(dòng)物數(shù)）整除，余數(shù)為0，將A組第7只動(dòng)物（25號）調(diào)配給D組；下一個(gè)：50/6（6為A組動(dòng)物數(shù)）余2，將A組第2只動(dòng)物（4號）調(diào)配給D組；接下來26/6（6為C組動(dòng)物數(shù)）余2，將C組第2只動(dòng)物（9號）給D組。余類推，最后調(diào)整分組成表2所示。雌性動(dòng)物也按上法分組，然后將雌、雄動(dòng)物合組進(jìn)行試驗(yàn)。表2-230只動(dòng)物隨機(jī)分組組別 鼠 號 組別 鼠 號A 1，14，17，19，23 D 4， 9，25，26，27B 5，8， 10，13，15 E 2， 6，12，24，28C 7，16，20，22，29 F 3，11，18，21，30附表：隨機(jī)數(shù)字表

IK22779J398dIK22779J398d421753316301637S5933El123429576。863244181?07924&2G623E9775234240647452362S199E378594耨12702917n1356621837359949572277160315047231工6933243€834301370745725B57627423786530039682961?99498942.4IC90S2S659112794750635241016203：J23IS26333196jS91176667406714149031451168G551IS00204678739064195897790526937060079710S323G8718&85852699616353J46552687517527758719026592119412352559960加三0816991253gOS9034535?743785220439430979137748SS75?01814909G2370DO4954135d8257245506881695550719736d5607B!309472796544i171￡580984IS074499829777778i509226JJ97833950OS初403320382696S350S77588429545”3327143409502789871955743077405929976g6048559065736637322030Eg4g6910?283626411120609197466333251263&423897015096443349136405719586757388OS903396027519975140140215061593202235321513099842996454876647545837738070875936224171H615072235223331231044969963199F368689d5828-tt$693gO330。9173Bl53947973S22E212295754249380。030690173793237877047447679￡IQ5Q7175524207U3819174609627983861962831146322407453214030056763142340796￡i?1389510374971?259347166-j361600代59346&492015370049U2.278 2671913867549657冷9朧107784570329537591933。67190071740294373$0279784504乳877568Bl41348682539111056509685?274114死076062935504Q33331090190107S069203515977617162991573320811124￡10506742267863幀&5工24194962f]&693Q2X339104748458&3581330376453759030909779319823352468628Q5Q32724葭3932R2224978383日373G20鄴432176335Q:%12867358C7Id51flO13429052847727067650031020148588力弓M疆940772足口22025353544206&7931776371304703324。甘5d044318667912720734155285GB604404334G09521358IS24769G4692d245IQ45650426弘252G57276。472129居7670903086169253561$400174乳6200?必。85768320379022981222085933S243903954164g3S4078788962595678068s06512916934495926316321755857413082701504d952736990702133607134443893024卻1243筑9035引:「：749-1800401州31544631728944056。02480770379437306932H4 26 34 91 6483 92 12 06 7644 39 52 38 7999 66 0^ 75 "08 02 73 43 2855 23 64 05 0310 93 72 胎 719385791075866042。4羽358529如3907742119309777例U809477U切90397772NEIA3863&&11808B0797於571554559552976Q49049111Q4966724404873519202023703313845943038027550959；4851840B二二27E52639M571600116607527495M4936判445947959313300267741733529105707458057709三1295G2429，?洎944457169115293939029S743DE3259932702397171149171?9910723482€35465601507打664953911328473EK039948816046167879089007633（六）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被毛去除方法方法有三種：剪毛、拔毛和脫毛。1.剪毛固定動(dòng)物后，用粗剪刀剪去所需部位的被毛。應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①把剪刀貼緊皮膚剪，不可用手提起被毛，以免剪破皮膚；②依次剪毛，不要亂剪；③剪下來的被毛集中在一個(gè)容器內(nèi)，勿遺留在手術(shù)野和操作臺周圍。.拔毛多用于兔耳緣靜脈注射或取血時(shí)，以及給大、小鼠作尾靜脈注射時(shí)，需用拇指、食指將局部被毛拔去，以利操作。.脫毛脫毛系指用化學(xué)藥品脫去動(dòng)物的被毛，適用于無菌手術(shù)野的準(zhǔn)備以及觀察動(dòng)物局部皮膚血液循環(huán)和病理變化。常用硫化鋇或依據(jù)脫毛劑配方配制脫毛劑。（七）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒途徑和方法毒理學(xué)試驗(yàn)中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射〉皮下注射〉經(jīng)口〉皮內(nèi)注射＞其他途徑（如經(jīng)皮等）。毒理學(xué)則主要采用經(jīng)口（胃腸道）染毒常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。⑴灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。一般灌胃深度從口至劍突下，最好是利用等容量灌胃法，即受試物配制成不同濃度，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時(shí)（因小鼠消化吸收和代謝速度較快），均不停飲水。灌胃后2?4小時(shí)提供飼料。經(jīng)口多次染毒，一般不禁食，但應(yīng)每日定時(shí)染毒。灌胃法優(yōu)點(diǎn)是劑量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是工作量大，并有傷及食道或誤入氣管的可能。灌胃針與灌胃方法：圖2-9灌胃針（規(guī)格：直徑XL50mm、XL70mm）圖2-10小鼠灌胃法

圖2-11大鼠灌胃法⑵吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動(dòng)物咽下，此法劑量準(zhǔn)確，適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。⑶喂飼：將受試物摻入動(dòng)物飼料或飲水中供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自行攝入。飼料中摻入受試物不應(yīng)超過5%,以免造成飼料營養(yǎng)成分改變而影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長發(fā)育。喂飼法符合人類接觸受試物的實(shí)際情況，但缺點(diǎn)多，如適□性差的受試物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物拒食；易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。而且，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)單籠喂飼，以食物消耗量計(jì)算其實(shí)際染毒劑量。（八）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物材料采集和制備1.動(dòng)物常用采血方法（1）大、小鼠鼠尾采血方法：適用于需血量少的實(shí)驗(yàn)。方法：將動(dòng)物固定后，把鼠尾浸入5?50℃溫水中使尾靜脈充血，擦干皮膚后，再用酒精棉球擦拭消毒。剪去尾尖約0.2?0.3cm）,拭去第一滴血，用血色素吸管（根據(jù)需要事先在吸管內(nèi)加入與不加抗凝劑）吸取一定量尾血，然后用于棉球壓迫止血。也可以不剪尾，以lml注射器連上7?8號針頭直接刺破尾靜脈進(jìn)行定量采血。⑵眼眶靜脈叢采血法：操作者以左手拇指、食指緊緊握住大鼠或小鼠頸部壓迫頸部兩側(cè)使眶后靜脈叢充血（注意用力要恰當(dāng)，以防止動(dòng)物窒息死亡），右手持玻璃毛細(xì)管從一側(cè)眼內(nèi)眥部以45角刺入，捻轉(zhuǎn)前進(jìn)。如無阻力繼續(xù)刺人，有阻力就抽出玻璃毛細(xì)管調(diào)整方向后再刺入，直至出血為止。右手持容器收集血液后，拔出毛細(xì)管，用干棉球壓迫止血。圖2-12小鼠眶靜脈叢（竇）采血⑶腹主動(dòng)脈或股動(dòng)（靜）脈采血法：為一次性采血方法。大、小鼠麻醉后，仰臥位固定動(dòng)物，剪開腹腔，剝離暴露腹主動(dòng)脈或暴露股動(dòng)（靜）脈，用注射器刺人采血.⑷斷頭采血法：該法可用于大、小鼠。操作者左手握住動(dòng)物，右手持剪刀，快速剪斷頭頸部，倒立動(dòng)物將血液滴入容器。注意防止剪斷的毛發(fā)掉入接血容器中。也可用大鼠斷頭器斷頭后，倒立動(dòng)物接血。⑸家兔耳緣靜脈采血法：家兔在兔盒中固定，拔掉一側(cè)耳緣部細(xì)毛，輕輕以手指彈耳，使耳緣靜脈充血，酒精消毒。左手壓迫耳根，右手持針刺破靜脈收集血液；或直接用注射器進(jìn)針，耳緣靜脈采血。⑹心臟采血法：將兔或大、小鼠以仰臥位固定，家兔需在左側(cè)胸3一4肋部位剪毛，常規(guī)消毒。于第3?4肋間近胸骨左緣處，手觸心搏最強(qiáng)部位進(jìn)針，采血。采血畢迅速拔針，用酒精棉球壓迫止血。大、小鼠則在手觸心搏最明顯處進(jìn)針。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每次（日）采血量不可過多，最大安全采血量見表2-1。 表2-3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全采血量 動(dòng)物品種 最大安全采血量（1ml） 最小致死采血量（ml）小鼠大鼠豚鼠家兔 2.動(dòng)物尿液的收集收集大動(dòng)物與小動(dòng)物的尿液，一般使用不同類型的代謝籠。代謝籠主要由備有動(dòng)物飲水和裝飼料的籠體、糞尿分離器和收集尿液容器組成。一般籠體為金屬與鐵絲制成，如實(shí)驗(yàn)要求防止金屬污染時(shí)，則代謝籠應(yīng)用玻璃或有機(jī)玻璃制作。兔、狗等大動(dòng)物也可用導(dǎo)尿法收集尿液。為了使收集的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尿液滿足試驗(yàn)需要，可在收尿前給動(dòng)物一定量的水，如大鼠可先行灌胃1?5ml水或腹腔注射生理鹽水.（九）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處死方法：.頸椎脫臼法左手按住鼠頭，右手抓住鼠尾猛力向后拉，使動(dòng)物頸椎拉斷脫節(jié)而立即死亡。此法多用于處死小鼠。.斷頭法操作者用右手按住大鼠或小鼠頭部，左手握住背部，露出頸部，助手用大剪刀或斷頭器剪斷頸部使之死亡。也可使用斷頭器。.擊打法右手抓住鼠尾，提起，用力摔打其頭部；鼠痙攣后立即死亡。也可用小木錘或器具猛力擊打動(dòng)物頭部，使其立即死亡，常用于處死家兔或大鼠。.麻醉致死法在密閉容器中預(yù)先放入麻醉劑（氯仿或乙醚），然后將動(dòng)物放入，密封蓋好，使動(dòng)物吸人過量麻醉劑致死。.麻醉后急性放血法該法多用于處死大鼠。先腹腔注射麻醉動(dòng)物后，固定動(dòng)物于仰臥位，左手持鑷子提起大腿內(nèi)側(cè)皮膚，右手用剪刀作一切口并向腹股溝方向剪開皮膚，皮膚切口長約3—4cm。用鑷子分離筋膜，于腹股溝中點(diǎn)大腿內(nèi)側(cè)深部，暴露股動(dòng)脈和靜脈，用剪子剪斷股動(dòng)脈即有大量血液流出，動(dòng)物迅速死亡。.空氣栓塞法用注射器向動(dòng)物靜脈內(nèi)迅速注入一定量的空氣，使之形成氣栓栓塞血管，引起循環(huán)障礙致死。該法適用于大動(dòng)物，如兔、狗、猴等。使用時(shí)注意需注入足夠量的空氣。.化學(xué)藥物致死法此法適用于較大動(dòng)物如兔或狗等。方法是給動(dòng)物靜脈注射化學(xué)藥物而致死。常用10%KCI或10%甲醛溶液進(jìn)行靜脈注射。.開放性氣胸法將動(dòng)物開胸，造成開放性氣胸，此耐胸膜腔的壓力與大氣壓力相等，肺臟因受大氣壓縮發(fā)生萎縮、縱隔擺動(dòng)使動(dòng)物窒息而死。實(shí)驗(yàn)三滅多威經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)一、目的化學(xué)毒物經(jīng)□急性毒性試驗(yàn)是研究化學(xué)物毒性效應(yīng)的基本試驗(yàn)。本次實(shí)習(xí)的目的是學(xué)習(xí)急性毒性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，學(xué)會(huì)動(dòng)物分組方法，掌握經(jīng)口灌胃技術(shù)和中毒癥狀的觀察。二、原理選擇健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，根據(jù)體重按隨機(jī)分組的方法，依據(jù)ld50計(jì)算的設(shè)計(jì)原則將動(dòng)物分成數(shù)個(gè)染毒組。一次或24h內(nèi)多次給予受試物后，了解動(dòng)物所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，觀察受試物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，求出半數(shù)致死劑量（ld50）,并根據(jù)ld50值將受試物進(jìn)行急性毒性分級。三、內(nèi)容.健康小鼠的選擇，性別的辨認(rèn)。.稱重、編號和隨機(jī)分組方法。.受試化學(xué)物溶液的配制。.小鼠經(jīng)口灌胃操作技術(shù)。.毒性體征的觀察、LD50計(jì)算和毒性分級。四、材料和試劑.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年昆明小鼠60只，體重22g-24g,雌雄各半。.器材動(dòng)物稱（感應(yīng)量1000g、灌胃針（小鼠用）、注射器（1ml）、刻度吸管、、、、10.0ml）、容量瓶（10ml）、燒杯（10、250m1）、滴管、編號筆、小瓷盤、動(dòng)物籠。.試劑受試物：滅多威（工業(yè)品，含量40%）,苦味酸酒精飽和液。五、操作步驟（一）健康小鼠的選擇（見實(shí)習(xí)二），本次實(shí)驗(yàn)提供健康小鼠。（二）性別辨認(rèn)（見實(shí)習(xí)二）（三）小鼠稱重、編號與分組：.稱重稱量小鼠體重的秤，其感應(yīng)量需在0.1g以下，并經(jīng)過校正。稱量時(shí)注意輕抓輕放，避免激惹小鼠，等小鼠安靜后記錄體重讀數(shù)，以g表示。.編號染色法編號（見實(shí)習(xí)二）.分組體重均衡法分組（見實(shí)習(xí)二）（四）劑量設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)劑量組，設(shè)計(jì)方案如下：TOC\o"1-5"\h\z組 另IJ 1 2 3 4 5 6劑量（mg/kg） 100灌胃液濃度（mg/ml） 5（五）受試物的配制實(shí)驗(yàn)給藥的劑型，可視毒物的溶解性能采用水溶液、混懸液、油劑或乳劑。本次實(shí)驗(yàn)用水溶液。非吸入染毒實(shí)驗(yàn)，各劑量組多按單位體重給予等容量藥液的方法給藥，故需先確定單位體重給藥容量（小鼠灌胃通常用?0.2m1/10g體重），然后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最大劑組藥液濃度計(jì)算配制所需的毒物量,配成第I號藥液，再按設(shè)計(jì)的組距，逐組稀釋，配制出所需組數(shù)的藥液。1.滅多威灌胃液的配制，按照上述設(shè)計(jì)的6個(gè)劑量組：最大劑量組為100mg/kg體重（1mg/10g）設(shè)給藥容量為0.2m1/10g體重則藥液濃度應(yīng)為1mg/0.2m1（5mg/ml）。配制100m1藥液需受試物的量為：5mg/m1x100m1=500mg準(zhǔn)確稱取滅多威500mg，用少量蒸餾水溶解后，移入100m1容量瓶，然后加蒸餾水稀釋至刻度，此溶液濃度為5mg/ml（實(shí)驗(yàn)教師已配好）。余下各組需學(xué)生自行配制。（六）灌胃操作小鼠灌胃法（見實(shí)習(xí)二實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的染毒途徑和方法）：采用專用小鼠灌胃針，安裝在1ml的注射器上，吸取所需的滅多威溶液，左手抓住小鼠的雙耳后、頸部的皮膚，用無名指、小手指和大魚際肌將其尾根部壓緊，將小鼠固定成垂直體位，腹部面向操作者。注意使動(dòng)物的上消化道固定成一直線。右手持注射器，將針頭由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避開牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺阻力消失，即可深入至胃部。如遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬不能強(qiáng)行插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物立即死亡。注意要點(diǎn)：①小鼠一定要固定好。②頭部和頸部保持平展。③進(jìn)針方向正確。④一定要沿著口角進(jìn)針，再順著食管方向插入胃內(nèi)；⑤決不可進(jìn)針不順就硬向里插。一般進(jìn)針深度小鼠?4cm,大鼠或豚鼠4?6cm。為了驗(yàn)明是否已正確地插入胃部，可輕輕回抽注射器，如無氣泡抽出，表明已插入胃中；如有大量氣泡，則提示誤插氣管，應(yīng)抽出重插。隨后將受試物溶液注入。灌胃容量小鼠通常為?1ml,大鼠1?4ml,豚鼠1?5ml。（七）中毒體征和動(dòng)物死亡情況觀察和ld50計(jì)算.中毒癥狀染毒后注意觀察毒性體征和死亡情況。高劑量組動(dòng)物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應(yīng)即刻密切觀察。觀察和記錄中毒體征及出現(xiàn)的時(shí)間、死亡數(shù)量和時(shí)間及死亡前的特征。根據(jù)觀察情況分析中毒特點(diǎn)和毒作用靶器官。按照實(shí)驗(yàn)結(jié)果，填寫急性毒性實(shí)驗(yàn)記錄表。染毒時(shí)間2小時(shí)。表3-1急性毒性實(shí)驗(yàn)原始記錄受試物名稱： 動(dòng)物種屬品系： 性別：動(dòng)物來源及合格證號： 染毒途徑： 劑量組別:室溫： 日期：動(dòng)物體重灌胃量體征及出現(xiàn)時(shí)間編號(g)(ml)震抽流針尖樣管狀側(cè)腹式死顫搐涎瞳孔尾 臥呼吸亡12345實(shí)驗(yàn)操作者： 實(shí)驗(yàn)記錄者:.LD50計(jì)算采用改進(jìn)寇氏法求出LD50及95%的可信限范圍，計(jì)算方法見附錄。六、結(jié)果評定根據(jù)小鼠中毒體征、死亡時(shí)間和特征、LD50,參照農(nóng)藥急性毒性分級（見表3-2經(jīng)口LD50）進(jìn)行評定，判斷該受試物的毒性大小及毒性特征。表3-2農(nóng)藥的急性毒性分級［經(jīng)口LD50（mg/kg）］毒性分級 劇毒 高毒 中等毒 低毒mg/kg 〈5 5? 50?500 〉500（引自:張橋主編的衛(wèi)生毒理基礎(chǔ)衛(wèi)生毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法.北京：人民衛(wèi)生出版社.2001,215）七、注意事項(xiàng).注意自我保護(hù)。.灌胃前，各組受試物溶液均應(yīng)充分混勻。.灌胃時(shí)，推進(jìn)速度不能太快或太慢，以免動(dòng)物將藥液嘔出或因掙扎而傷害上消化道的粘膜。.應(yīng)選用針尖圓純的灌胃針頭進(jìn)行灌胃。.中毒死亡及脫臼處死的小鼠，裝進(jìn)塑料袋（注意不要夾帶任何雜物放進(jìn)塑料袋），送到801室集中放到專用紡織袋置于冰柜冷凍貯存待銷毀。.按規(guī)定方法銷毀剩余受試物。八、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、品系、性別及來源。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食和健康狀況。.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重和隨機(jī)分組情況。.受試物的名稱、來源、純度、性狀等情況。.受試物的配制和溶媒。.詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)觀察的中毒表現(xiàn)和死亡情況等（表1）。.LD50的計(jì)算方法和結(jié)果。.受試物的毒性分級、分級依據(jù)和結(jié)果評價(jià)。九、附錄LD50（LC50）計(jì)算方法:改進(jìn)寇氏法改進(jìn)寇氏法是利用對數(shù)與死亡率呈S型曲線而設(shè)計(jì)的方法，又稱Karber法或平均致死量法。該法計(jì)算簡便，準(zhǔn)確率高，是較為常用的方法。本法要求每個(gè)染毒劑量組動(dòng)物數(shù)要相同，各劑量組組距呈等比級數(shù)，死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率呈＜20%,最高劑量組死亡率＞80%。計(jì)算公式如下：m=Xk-i（Xp一0.5）Sm=i儼pq式中：m:lgLD5oi:相鄰兩劑量組之間之對數(shù)劑量差值；Xk：最大劑量的對數(shù)值；q:存活率(q=1-p)；Ep：各劑量組死亡率總和；n:每組動(dòng)物數(shù)。例如：小鼠經(jīng)□給予某化學(xué)物質(zhì)的劑量和死亡數(shù)資料見下表2。表3-3某化學(xué)物質(zhì)小鼠經(jīng)口染毒死亡情況組另IJ _劑量動(dòng)物數(shù)(n)死亡數(shù)(只)死亡率(P)存活率(q)p.qMg/kg對數(shù)11002102310541075109i=2P=按式計(jì)算得：lgLD50==Sm=,0.160.250.210.09++ +10 101010=lgLD50及其95%可信限為土X=±所以lgLD50及95%可信區(qū)間范圍為kg(?kg)。實(shí)驗(yàn)四苯經(jīng)呼吸道急性毒性試驗(yàn)一.目的經(jīng)呼吸道急性毒性試驗(yàn)是衛(wèi)生毒理學(xué)的重要基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。外源性化學(xué)物經(jīng)呼吸道吸人是工業(yè)毒理學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)中最常見的接觸途徑之一，也是藥品和農(nóng)藥的接觸途徑之一。常用于研究氣態(tài)、蒸氣態(tài)、氣溶膠、煙塵、粉塵狀的外源性化學(xué)物對呼吸道損傷、吸收后對機(jī)體損害?？汕蟪鑫私佑|的半數(shù)致死濃度（京50），并進(jìn)行急性毒性分級。本實(shí)習(xí)的目的是學(xué)習(xí)靜式呼吸道染毒技術(shù)，掌握lc50的實(shí)驗(yàn)步驟和方法。二.原理呼吸道吸人染毒可分為兩種方式，一是動(dòng)式吸入，一是靜式吸人。其類型又可分為兩種，一是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體置于染毒柜中；一是只將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的口鼻部位與染毒柜中含受試物的空氣接觸，身體其他部位置于染毒柜外，也稱為面罩吸人染毒。靜式吸入染毒系將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于一個(gè)一定的體積的密閉容器內(nèi)，加入定量的易揮發(fā)液態(tài)受試化合物或一定體積的氣態(tài)受試化合物，在容器內(nèi)形成所需的受試化合物的空氣環(huán)境。接觸一定時(shí)間（一般為2h或4h）后，觀察動(dòng)物的中毒反應(yīng)，并根據(jù)動(dòng)物的死亡情況和相應(yīng)的受試物濃度，求出lc50。這種接觸方式，染毒柜的體積與所放置的動(dòng)物數(shù)量應(yīng)相適應(yīng)，否則會(huì)出現(xiàn)缺氧與二氧化碳潴留現(xiàn)象。一般要求在接觸期內(nèi)染毒柜的氧分壓不能低于19%,二氧化碳分壓不能超過％。染毒柜體積、放置動(dòng)物種類和數(shù)量及放置時(shí)間相互關(guān)系見表3。表4-1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最低需氣量及不同染毒柜容積應(yīng)放置的動(dòng)物數(shù)（染毒2h）動(dòng)物種屬呼吸通氣量最低需氣量不同容積染毒柜放置動(dòng)物數(shù)（只）(L/h)(L/h)25L50L100L300L1000L小鼠3?56?1012?1536?40120?150大鼠011?25?616?18豚鼠011?25?616?18貓0003?49?10家兔00014?5猴00013?4狗00001（引自:南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院王心如主編.毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社.2005,15）染毒柜：有機(jī)玻璃制成，現(xiàn)有容積有60L和100L兩種規(guī)格。柜頂蓋部有三個(gè)附件。一個(gè)是投藥孔，一個(gè)是用于混勻蒸氣或氣體的小電扇，一個(gè)是插入溫度計(jì)的孔。在柜壁上掛有一個(gè)小不銹鋼碟為接受和蒸發(fā)液態(tài)受試物的藥物蒸發(fā)器。（見下圖）圖4-1有機(jī)玻璃靜式染毒柜.內(nèi)容.靜式呼吸道吸人染毒操作。.毒性體征的觀察和LC50計(jì)算。.試劑和材料（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年昆明小鼠60只，體重22-24g，雌雄各半。（二）器材靜式吸入染毒柜有60L和100L）兩種規(guī)格、動(dòng)物稱（電子天平，感應(yīng)量1000g）、刻度吸管（0.2、0.5、1.0、5.0m1）、洗耳球、動(dòng)物籠、編號筆。（三）試劑.受試物：苯（分析純）、d=0.878g/ml。.苦味酸酒精飽和液。.操作步驟.小鼠稱重、編號與分組（見實(shí)習(xí)二）。.劑量設(shè)計(jì)設(shè)6各劑量組，具體方案如下：組別 123456劑量（mg/L） 115靜式染毒多采用計(jì)算方法折算染毒柜內(nèi)受試化合物的濃度，易揮發(fā)液體化合物濃度計(jì)算式為：a.dC=lx1000式中:C-------實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)受試化合物的濃度（mg/L）;應(yīng)加入受試化合物的量（ml）;d-------受試化合物的比重（g/ml）;L——染毒柜體積（L）.呼吸道吸人染毒將已稱重、編號的小鼠放入染毒柜內(nèi)，加蓋時(shí)注意藍(lán)色小蓋帽（為加藥孔）對準(zhǔn)掛在柜臂的小不銹鋼碟（接物蒸發(fā)器）并扣緊，根據(jù)設(shè)計(jì)的劑量濃度及染毒柜體積，計(jì)算出應(yīng)加入苯溶液的量，用刻度吸管吸取苯溶液并經(jīng)加藥孔加到不銹鋼碟上，接通電源小電扇開啟，計(jì)時(shí)。觀察、記錄中毒體征和動(dòng)物死亡情況，按表填寫（參照實(shí)習(xí)三的表1）。染毒時(shí)間2小時(shí)。.LC50計(jì)算參照實(shí)習(xí)三LD50計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。.結(jié)果評定依據(jù)小鼠中毒體征、死亡時(shí)間、LC50,參考相應(yīng)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，判斷該受試物的毒性大小及其毒性特征。表4-2化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級（小鼠一次吸入2小時(shí)LC50）毒性分級劇毒高毒中等毒低毒g/ml<~〈~<50)50.實(shí)驗(yàn)報(bào)告見經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)實(shí)習(xí)要求。.注意事項(xiàng).注意染毒柜密閉，保持柜內(nèi)受試物濃度，防止污染周圍環(huán)境和影響操作者。.染毒結(jié)束，應(yīng)在啟動(dòng)的通風(fēng)柜內(nèi)開啟染毒柜，待20分鐘后取出小鼠，活的脫臼處死。.中毒死亡及脫臼處死的小鼠，裝進(jìn)塑料袋（注意不要夾帶任何雜物放進(jìn)塑料袋），集中送到801室，置于冰柜專用紡織袋冷凍貯存待銷毀。實(shí)驗(yàn)五蓄積毒性試驗(yàn)一、目的蓄積毒性試驗(yàn)是評價(jià)外源化學(xué)物有無蓄積毒性的重要方法。本實(shí)習(xí)的目的是了解蓄積毒性試驗(yàn)的原理，掌握蓄積系數(shù)法。二、原理某些毒物多次以小劑量反復(fù)進(jìn)入體內(nèi)，可表現(xiàn)出機(jī)體對該毒物的反應(yīng)性增強(qiáng)，即一次染毒不引起反應(yīng)的劑量，如多次重復(fù)染毒，則可能引起明顯的反應(yīng)甚至死亡。這表明毒物有蓄積毒性。毒物的蓄積與進(jìn)入機(jī)體的毒物劑量、重復(fù)染毒間隔時(shí)間、毒物的毒性及其代謝特點(diǎn)和機(jī)體反應(yīng)特性條件有關(guān)。三、試劑和材料.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年大鼠或小鼠。.器材注射器、灌胃針、動(dòng)物體重秤。四、實(shí)驗(yàn)方法采用蓄積系數(shù)法：選用大鼠或小鼠以經(jīng)口灌胃或腹腔注射方法進(jìn)行試驗(yàn)，先進(jìn)行受試物的急性毒性試驗(yàn)，求出LD50。然后選取相同條件的動(dòng)物40只（或更多），隨機(jī)分為試驗(yàn)和對照2組，每組至少20只，雌雄各半。在1/20?gLD50范圍內(nèi)選擇劑量，以相同染毒途徑、定時(shí)、定量對試驗(yàn)組染毒。觀察記錄動(dòng)物死亡數(shù)。當(dāng)試驗(yàn)組累積發(fā)生一半動(dòng)物死亡時(shí)終止染毒。累計(jì)自實(shí)驗(yàn)開始到出現(xiàn)50%動(dòng)物死亡時(shí)的累積染毒總劑量（工LD50[n]），用公式1計(jì)算該毒物的蓄積系數(shù)K值：蓄積系數(shù)K=ELD50[n]/ELD50[1]（公式1）式中ELD50⑴：一次染毒的50%的致死劑量；eld50m:引起動(dòng)物死亡的累計(jì)總劑量。根據(jù)蓄積系數(shù)值，可將毒物的蓄積作用分4級（表5—1）。另外一種測定毒物蓄積系數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法是：動(dòng)物每天按體重給一定劑量的毒物染毒。第1?4天，給ELDs。劑量，然后染毒劑量按倍每4天遞增一次，染毒劑量安排見表5—2。表5—1按蓄積系數(shù)對蓄積作用分級蓄積系數(shù) 分級0? 極強(qiáng)蓄積1? 強(qiáng)蓄積3? 中等蓄積5? 弱蓄積表6—2蓄積試