地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和結(jié)果分析1整理ppt主要內(nèi)容一、什么是地中海貧血及分布二、地中海貧血的致病機(jī)制三、地中海貧血的基因診斷四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法五、檢測(cè)結(jié)果分析及報(bào)告2整理ppt一、什么是地中海貧血定義：由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋白肽鏈合成減少或缺失，導(dǎo)致血紅蛋白的α鏈/非α鏈比例失衡，而引起的一組遺傳性溶血性疾病，亦稱海洋性貧血。

血紅蛋白病：由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的一組遺傳性疾病。☆地中海貧血是最常見(jiàn)的血紅蛋白病，珠蛋白合成障礙性貧血為國(guó)內(nèi)稱呼，國(guó)外不用。3整理ppt地中海貧血分類地中海貧血

地中海貧血

地中海貧血δ

地中海貧血γ

地中海貧血δ

地中海貧血εγδ

地中海貧血血紅蛋白變異體溶血性異常血紅蛋白（如HbS、C等）地中海貧血樣變異（如HbCS、E等）其他異常血紅蛋白（如HbM、Coimbra等）4整理ppt

地中海貧血分類1、按照一個(gè)單倍型上的

-珠蛋白基因的功能缺陷定義

0地貧（也有稱地貧1）：

-珠蛋白基因完全基因記為--/喪失功能。

+地貧（也有稱地貧2）：-珠蛋白基因?；蛴洖?/留有部分功能。5整理ppt

地中海貧血分類2、按照肽鏈內(nèi)切酶分型

缺失型地貧：珠蛋白肽鏈存在片段缺失而造成功能缺陷非缺失型地貧：珠蛋白肽鏈上不存在缺失，而是（點(diǎn)突變）由于基因的點(diǎn)突變?cè)斐傻碾逆湽δ苋毕?整理ppt

地中海貧血分類3、根據(jù)

基因缺失或突變個(gè)數(shù)可分為：靜止型：缺失1個(gè)基因，基因型記為-/1個(gè)基因突變，基因型記為/T輕型：缺失2個(gè)基因，基因型記為：--/或-/-2個(gè)基因突變，基因型記為：

T/T

中間型：缺失3個(gè)基因，基因型記為：--/-缺失與突變混合，基因型為：--/

T或純合突變重型：缺失4個(gè)基因，基因型記為：--/--缺失與突變混合，基因型為：--/

T

7整理ppt

地中海貧血分類1、根據(jù)肽鏈的功能缺失

0地貧：珠蛋白基因功能完全喪失，不能合成肽鏈

＋地貧：珠蛋白基因尚保留部分功能2、根據(jù)臨床癥狀靜止型地貧：突變雜合子（N/+），中國(guó)人少見(jiàn)輕型型地貧：突變雜合子（N/+、0/N）中間型地貧：突變雙重雜合子/突變純合子（+/+、0/+）重型地貧：突變雙重雜合子/突變純合子（0/0、0/+）8整理ppt中國(guó)人HPFH和δβ-地貧的基因突變類型及表型特征

突變類型缺失長(zhǎng)度(kb，缺失型)

或受累基因(非缺失型)HbF(%)Gγ(%)其它種族缺失型Gγ+(Aγδβ)0-地貧中國(guó)型≈1009.3～21.283～100—廣州型＞4319.495—云南型～909.3～16.772～90—GγAγ-HPFH東南亞型29.7±0.514.1～27.057～63越南、柬埔寨人Aγ-HPFH-196(C→T)Aγ14.3～20.981～95意大利人GγAγδβ-地貧-29(A→G)β22.340—9整理ppt世界地中海貧血的流行分布10整理ppt廣西地中海貧血的流行分布853共5789例224例834例790例1033例1349例1559例Baise

Hezhou

Yulin

FangchengguangLiuzhouNanningXiong,etal.ClinGenet201011整理ppt廣西地中海貧血的流行分布血紅蛋白病分組陽(yáng)性樣本數(shù)%α-地中海貧血88615.32靜止型攜帶者3636.27α-地中海貧血特征4988.6HbH病250.43β-地中海貧血3706.39攜帶者2874.96復(fù)合α-地中海貧血791.36中間型地中海貧血40.07δ-地中海貧血90.16攜帶者60.1復(fù)合α-地中海貧血30.05血紅蛋白結(jié)構(gòu)變異220.38攜帶者170.29復(fù)合α-地中海貧血40.07復(fù)合β-地中海貧血10.02總計(jì)128722.2512整理ppt引起

珠蛋白表達(dá)降低的常見(jiàn)缺失突變類型分布––MC10kb0kb20kb30kb40kb–10kb3’HVRinterξHVR5’3’

2

1

2

1

––THAI––BRIT––FIL––MED––SEA

–

4.2–

3.7–

2.7––SPAN––HW–

27.6–

11.1–

2.413整理pptBlackBelgianIndianMalaysian2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseS.E.AsianTaiwanese

0kb50kb100kb150kb

G

A

LCR引起

地中海貧血常見(jiàn)的基因缺失突變類型分步14整理ppt12種見(jiàn)于中國(guó)人群的

2/1珠蛋白基因點(diǎn)突變

CD31CD125EXONIEXONIIEXONIIIIVSIIVS

IIUTRUTR5’3’CD13CD59CD122CD142CD44CD49CD30

2

1MissensemutationMinideletionorinsersionTerminationmutationFrameshiftCD78CD74CD11815整理ppt啟動(dòng)子突變異常剪接起始密碼突變移碼突變無(wú)義突變3’UTR突變EXON1IVS1EXON2EXON3

IVS2顯性突變5’3’

46種見(jiàn)于中國(guó)南方人群的

-珠蛋白基因點(diǎn)突變

16整理ppt中國(guó)南方人群最為常見(jiàn)的地貧類型17整理ppt二、地中海貧血的致病機(jī)制

●胎兒血紅蛋白主要由兩條

珠蛋白鏈、兩條

珠蛋白鏈組成，還含有

γ鏈、?鏈、ζ鏈組成●成年人的血紅蛋白由兩條

珠蛋白鏈和兩條

珠蛋白鏈組成血紅蛋白紅細(xì)胞

鏈

鏈血紅素鐵

鏈

鏈18整理ppt二、地中海貧血的致病機(jī)制11p15.3β珠蛋白基因簇16p13.3α珠蛋白基因簇HbA

HS

40ζ

ψζψ

2

ψ

1

2

1θHS54321εGγAγψβδβ19整理ppt二、地中海貧血的致病機(jī)制人體不同發(fā)育時(shí)期的珠蛋白生成變化規(guī)律20整理ppt二、地中海貧血的致病機(jī)制靜態(tài)突變點(diǎn)突變片段突變動(dòng)態(tài)突變

堿基替換移碼突變串聯(lián)重復(fù)的三核苷酸序列隨著世代的傳遞而拷貝數(shù)逐代累加缺失重復(fù)重排基因突變的分子機(jī)制基因致病突變是地貧發(fā)生的分子基礎(chǔ)21整理ppt二、地中海貧血的致病機(jī)制22整理ppt三、地中海貧血基因分析1、Gap-PCR用于α和β等缺失型地貧的檢測(cè)ψα2ψα1ψξ1

α2α1θ1SEA3.74.2ABCDEFG原理：普通的酶無(wú)法擴(kuò)增出長(zhǎng)距離的片段，通過(guò)設(shè)計(jì)出與缺失序列的兩側(cè)翼序列互補(bǔ)的引物，當(dāng)存在缺失時(shí)，由于肽鏈靠近從而擴(kuò)增出片段。23整理ppt24整理ppt三、地中海貧血基因分析2、PCR-RDB用于檢測(cè)α和β點(diǎn)突變PCR膜條雜交顯色25整理ppt26整理ppt三、地中海貧血基因分析地貧基因檢測(cè)的策略：α地貧：先檢測(cè)常見(jiàn)缺失型，然后檢測(cè)非缺失（點(diǎn)突變），最后是未知的缺失和突變位點(diǎn)。因?yàn)?gt;90%α地貧為常見(jiàn)的三種缺失型（--sea,-3.7,-4.2)。β地貧：先檢測(cè)點(diǎn)突變，然后檢測(cè)少見(jiàn)的缺失型。大部分β地貧都是點(diǎn)突變型。

27整理ppt血紅蛋白病的篩查及基因診斷的技術(shù)流程28整理ppt遺傳咨詢

產(chǎn)前地貧攜帶者篩查策略同時(shí)正常產(chǎn)檢對(duì)象（孕婦及其配偶）α地貧分子診斷

知情同意選擇胎兒產(chǎn)前基因診斷血液五分類分析（關(guān)注MCV和MCH）+血紅蛋白電泳（HbA2)雙方某項(xiàng)指標(biāo)均同時(shí)降低一方正常，另一方的指標(biāo)降低地貧全套檢查異常的一方做地貧全套檢查α-地貧特征β-地貧特征ID雙方均為α-地貧特征一方為α-地貧特征，另一方為ID或β-地貧特征+-單純性ID或單純性β-地貧雙方均為β-地貧特征ID或β-地貧特征的一方做α地貧分子診斷

夫婦雙方基因診斷血R正常的一方做α地貧分子診斷

-單純性ID或單純性β-地貧-++僅異常血紅蛋白必要時(shí)測(cè)序或選擇其中一種地貧檢測(cè)29整理ppt四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法1、融鏈曲線分析法用于檢測(cè)α或β缺失和點(diǎn)突變Thongperm,etal.JournalofMolecularDiagnostics.2010XiongF,etal.JMolDiagn.2011ChristinaV，etal.ClinicalChemistry.2003原理：根據(jù)每條肽鏈都有自己的Tm值，從而可以通過(guò)溫度差來(lái)判斷30整理ppt四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法2、MLPA（多重連接探針擴(kuò)增）用于尋找未知缺失斷裂點(diǎn)Xiao-FengWei，etal.AnnHematol.201131整理ppt四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法3、毛細(xì)管電泳可以檢測(cè)α非缺失CS（HbCS)和

βE地貧HbAHbEHbA2CanLiao,etal.EuropeanJournalofHaematology.201032整理ppt四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法4、DHPLC（變性高效液相色譜）用于缺失型和突變型地貧都可以李倩，南方醫(yī)科大學(xué)論文，201033整理ppt四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法5、基因序列測(cè)定（PCR+毛細(xì)管電泳）用于未知突變位點(diǎn)或確定缺失片段的位置

由于儀器比較貴重，技術(shù)要求高，目前尚未在臨床一線推廣，只在科研實(shí)驗(yàn)室里開展。AzamAmirianMSc，etal.ArchivesofIranianMedicine.201134整理ppt四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法6、母體血漿中胎兒游離核酸的測(cè)定嚴(yán)提珍，國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，200935整理ppt嚴(yán)提珍，國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，200936整理ppt五、檢測(cè)結(jié)果分析及報(bào)告

（一）地貧基因診斷1、--SEA/

2、

/

3、

/

4、--SEA/-

4.25、--SEA/-

4.26、--SEA/-

3.7

7、

/

8、

--SEA/

9、DNAMarkerα缺失型地貧電泳結(jié)果12345678937整理pptα非缺失雜交結(jié)果CS純合WS雜合未檢測(cè)到6種突變（注意不是正常）38整理ppt41-