綜合實(shí)驗報告書（2012~2013學(xué)年）實(shí)驗題目粒毛盤菌胞外多糖的提取及其脫蛋白前后抗氧化活性 學(xué)院名稱生物與食品工程學(xué)院專業(yè)（班級）生物工程10-1班姓名（學(xué)號）鄭沛20106274起訖日期2013年2月25日—2013年3月1日指導(dǎo)教師葉明2013年3月1日粒毛盤菌胞外多糖的提取及其脫蛋白前后抗氧化活生物工程10-1學(xué)號：20106274 姓名：鄭沛同組人員：許云龍摘要：對粒毛盤菌(Lachnumhyalopus)DP5胞外多糖的提取工藝,及其胞外多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，粒毛盤菌的胞外多糖具有一定體外抗氧化活性，對O2-、?OH均有較好的清除作用，并且其抗氧化性能力隨濃度升高而增強(qiáng)，而且較Vc要強(qiáng)。實(shí)驗中使用乙醇沉淀法提取的胞外多糖，并用分光光度法進(jìn)行試驗，測得粒毛盤菌對各氧化離子及基團(tuán)的清除率，證明其抗氧化活性。關(guān)鍵詞：粒毛盤菌多糖抗氧化活性StudyonextractiontechnologyandautioxidativeactivityofpolysaccharidesproducedbyLachnumhyalopus．Abstract：ExtractLachnumDP5extracellularpolysaccharide,andusetheVcasthepositivecontrolgrouptodeterminetheantioxidantcapacity.TheresultsshowthatthegrainofextracellularpolysaccharideMaoPanbacteriahavecertainantioxidantactivityinvitro,theO2-and?OHwerebetterremovaleffect,anditsoxidationresistanceabilityincreasedwithconcentration,andtheVcisbetter.Experimentsusingethanolprecipitationmethodtoextractextracellularpolysaccharides,usingspectrophotometrytotestandmeasuredgrainMaoPanbacteriumclearancerateofthegroupsforeachoxideionand,toproveitsantioxidantactivity.Keywords:LachnumhyalopuspolysaccharideAntioxidativeactivity粒毛盤菌屬隸屬于盤菌綱(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(HyaloscyPhaceae)，是廣泛分布于世界的一類腐生性真菌．長期以來，國內(nèi)外對粒毛盤菌分類和系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，在其發(fā)酵條件及代謝產(chǎn)物方面也有一些報道。研究表明，粒毛盤菌胞外多糖具有一定的生物活性，比如降血糖、降血脂和抗腫瘤等。本實(shí)驗對粒毛盤菌DP5胞外多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究。大量研究表明，機(jī)體的許多疾病與自由基氧化損傷有關(guān)，抗氧化多糖為自由基氧化損傷相關(guān)疾病的治療帶來新的希望。本研究對粒毛盤菌多糖的提取工藝及其多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，并且對其多糖脫蛋白前后的抗氧化活性進(jìn)行比較，以期為粒毛盤菌多糖的研發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1材料與方法 1.1材料1.1.1主要儀器DSX-280A滅菌鍋，HH-S恒溫水浴鍋，TDL-50B離心機(jī)，AR1140型電子分析天平，722分光光度計，RE-85旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，培養(yǎng)皿，燒杯，錐形瓶，試管，玻璃棒，移液管，酒精燈，量筒，接種針，容量瓶等實(shí)驗室常用儀器。1.1.2試劑1%K3[Fe(CN)6]，三氯乙酸，三氯化鐵，鄰苯三酚，Vc溶液，過氧化氫，水楊酸，硫酸亞鐵溶液，乙醇，Tris-HCL溶液（PH8.2）（配置：稱取12.114gTris溶解至1L，然后取50mL再取22.9mL的0.1moL/LHCL溶液混合，混勻稀釋至100mL）0.2moL/LPBS(PH6.6)(配置：62.5mL的0.2moL/L磷酸二氫鈉溶液與37.5mL的0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液）1.1.3材料粒毛盤菌(Lachnumhyalopus)DP5由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離保藏．1.2胞外多糖的提取1.2.1粒毛盤菌胞外多糖發(fā)酵的提取胞外多糖的提取：在150mL的錐形瓶中，裝入50mL基本發(fā)酵培養(yǎng)基，用打孔器接入直徑為3mm的已活化的菌塊，25℃，150r/min搖床培養(yǎng)十天。抽濾除去菌絲體，濾液濃縮后，加入3倍體積的乙醇，4℃靜止24h。離心棄去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌，真空干燥得胞外多糖粗品。1.2.2胞外多糖的脫蛋白采用Sevage法脫蛋白，取粒毛盤菌胞外多糖溶液加入1/3體積的Sevage（體積比氯仿：正丁醇=5:1），將混合物劇烈振搖20min，分液漏斗分液再靜止20min，分去水層與溶劑層交界處的變性蛋白，重復(fù)至水相與溶劑相的交界面無膠狀變性蛋白質(zhì)。1.2.3胞外多糖脫色，透析及冷凍干燥向粗多糖溶解液中加入其體積1/10的30%的過氧化氫，50℃恒溫脫色。將脫蛋白及脫色后的多糖水溶液置于透析袋（直徑25mm，截留分子量3500Da）中，自來水逆向透析12h，再用蒸餾水浸泡，將透析后的多糖溶液冷凍干燥即可得粒毛盤菌胞外多糖。1.3胞外多糖抗氧化活性測定1.3.1多糖還原能力測定取1mL樣品溶液加入0.5mL1%K3[Fe(CN)6]和0.2mL0.2moL/LPBS(PH6.6)于試管中50攝氏度水浴反應(yīng)20min，取出后用流水進(jìn)行冷卻，加入1mL10%三氯乙酸，3000r/min離心10min，取1.5mL上清液，加入3mL蒸餾水和0.2mL1%三氯化鐵搖勻，放置5min，以蒸餾水作為空白對照調(diào)零，700nm處測定吸光值。吸光度越大，表示多糖的還原能力越強(qiáng)。1.3.2對超氧陰離子自由基(O2-)的清除作用應(yīng)用鄰苯三酚自氧化體外模擬化學(xué)反應(yīng)。將0.5mI，3.0mmoL/L的鄰苯三酚加入到含不同濃度脫蛋白前后多糖溶液的pH8.2Tris—HCL緩沖液中，在兩液混合后10min內(nèi)每隔30s測425nm處的吸光值，以不加多糖的反應(yīng)液為空白對照，維生素C為陽性對照，計算多糖對超氧陰離子自由基(O2-)的清除率．清除率,=（A0-A）/A×100％其中：A0為鄰苯三酚自氧化速率，即自氧化曲線的斜率；A為加入不同濃度多糖后氧化曲線的斜率。1.3.3對?OH的清除作用測定利用過氧化氫與亞鐵離子的混合產(chǎn)生?OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉?OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm下有最大吸收。反應(yīng)體系中含8.8mmoL/L過氧化氫1mL，9mmoL/LFeSO41mL，9mmoL/L水楊酸/乙醇1mL，不同濃度（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0g/L）的胞內(nèi)脫蛋白前后多糖溶液1mL，最后加入過氧化氫啟動反應(yīng)，37攝氏度反應(yīng)半小時，，以蒸餾水為參比，在510nm下測量吸光度，考慮到多糖本身的吸光值，以9mmoL/LFeSO41mL,9mmoL/L水楊酸/乙醇1mL，不同濃度的多糖溶液1mL和1mL蒸餾水做對比，相同濃度的Vc作為陽性對照。清除率計算公式：清除率（%）=（A0—（AX—AX0））/A0其中A0為空白對照的吸光度，AX為加入多糖的吸光度，AX0為不加顯色劑過氧化氫多糖溶液本底的吸光度。1.3.4對DPPH自由基的清除作用測定取不同濃度的多糖溶液2mL與2mL2×10-4moL/LDPPH溶液均勻混合，30min后在525nm處測定其吸光度Ai，同時用同法測定2mL2×10-4moL/LDPPH溶液與2mL蒸餾水混合后的吸光度A，以及2mL不同濃度多糖溶液與2mL蒸餾水混合后的吸光度Aj，則清除率=[1一(Ai一Aj)／A]×100％．2結(jié)果與分析2.1對?OH基的清除作用測定由圖可知，脫蛋白前后多糖溶液對?OH的清除作用都隨濃度的增大而增大，且相同濃度的Vc對?OH的清除能力比脫蛋白前后的多糖都弱。但是當(dāng)濃度較低時，兩者相差不大。2.4對O2-的清除作用測定多糖對O2-的清除效果較好，隨著多糖濃度的增加，其對O2-的清除作用也逐漸增加，增加趨勢符合二項式y(tǒng)=—1.4279x2+23.902x+5.332，R2=0.8807。如下圖所示，當(dāng)濃度為1.2mg/l時，清除率最大，約為76%。3討論與心得3.1討論本次試驗是研究粒毛盤菌的胞外多糖，我國對多糖的研究起步較晚，但是發(fā)展很快。多糖有著復(fù)雜的理化特性，其中許多對生物化學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)及應(yīng)用有著大大的幫助。當(dāng)然多糖的結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，在各種不同的生物體中存在著各種不同的多糖，如甘蔗各種瓜果和微生物等，都能提取出多糖。本次試驗測得粒毛盤菌的胞外多糖具有抗氧化活性，對O2-、·OH、DPPH自由基的清除作用都明顯，以維生素C作為陽性對照組，通過比較，發(fā)現(xiàn)Vc的抗氧化性比同濃度的此類多糖要弱，無論是脫蛋白前還是脫蛋白后的多糖。3.2心得在實(shí)驗過程中，我們深深體會到了團(tuán)結(jié)的重要性，實(shí)驗中隊友的重要性不言而喻。當(dāng)然在實(shí)驗過程中就體現(xiàn)出了我們的各種經(jīng)驗的不足，也明白了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度對于實(shí)驗的完成度有著重要的作用，在這種綜合實(shí)驗中，每一步只要稍有差錯，就能造成整個實(shí)驗的失敗，從而需要耗費(fèi)更多的時間進(jìn)行不必要的步驟，甚至重頭再來。在這種為期綜合實(shí)驗中，合理安排時間是很重要的，將那些略顯復(fù)雜的操作盡快在白天完成，將等待的時間就放到晚上。然后在實(shí)驗中，我們也學(xué)會了一些以前沒用過的實(shí)驗儀器的使用。3.3致謝感謝葉明老師對我們實(shí)驗的計劃和支持，也感謝研究生杜湛學(xué)姐對我們實(shí)驗的全程悉心指導(dǎo)，對我們的問題更是不厭其煩。參考文獻(xiàn)[1]葉明,李世艷等,禾本科粒毛盤菌多糖提取及其抗氧化活性研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）,2009,35。[2]蔣長興，雞內(nèi)金多糖對高脂血癥大鼠血脂、血液流變學(xué)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響[J].中藥藥理與臨床,2012,05.[3]喬德亮,雙孢蘑菇多糖超聲波輔助提取及體外抗氧化活性[J].中藥材.[4]羅玲,周斌星,郭威,柴潔,李揚(yáng).普洱茶茶多糖的提取工藝的響應(yīng)面分析研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,30.[5]郭巧玲,楊學(xué)敏,謝建華,鄭寶東.菠蘿多糖脫色工藝的研究[J];漳州師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,03.[6]侯秀娟,沈勇根.化橘紅多糖的提取純化及抗氧化活性研究[J].中國釀造,2012,09.[7]ZhuangWY，HydeKD．NewspeciesofLachnumandPerrotiafromHongKong[J].Mycologia,2001,93．[8]李南薇,楊振立.木瓜葉多糖的提取及抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)與技術(shù),2012,11.綜合實(shí)驗報告成績評定合肥工業(yè)大學(xué)綜合實(shí)驗報告成績評定姓名鄭沛專業(yè)(班級)生物工程10-1班學(xué)號20106274實(shí)驗名稱