實時熒光定量per實驗報告篇一：實時熒光定量PCR方式簡介實時熒光定量PCR方式簡介—?實時熒光定量PCR的大體原理理論上,PCR進程是依照2n（n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進行模板的擴増。但在實際的PCR反映進程中,隨著反映的進行由于體系中各成份的消耗（主若是由于聚合酶活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴増,而是按線性的方式增加進入平臺期。因此在起始模板量與終點的熒光信號強度間沒有靠得住的相關性。如采納常規(guī)的終點檢測法（利用EB染色來判定擴增產(chǎn)物的多少,從而間接的判定起始拷貝量）,即便起始模板量相同經(jīng)PCR擴増、EB染色后也完全有可能取得不同的終點熒光信號強度。為了能準確判定樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的起始拷貝數(shù)，實時熒光定量PCR采納新的參數(shù)——Ct值,定量的全然原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關系。Ct值是如何取得的在實時熒光定量PCR的進程中,靶序列的擴増與熒光信號的檢測同時進行,定量PCR儀全程搜集熒光信號,實驗終止后分析軟件自動按數(shù)學算法扣除熒光本底信號并設定閾值從而取得每一個樣品的Ct值。Ct值的概念Ct值中的〃C〃代表Cycle（循環(huán)），〃t〃代表檢測threshhold（閾值），其含義是PCR擴増進程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也能夠明白得為擴増曲線與閾值線交點所對應的橫坐標。Ct值與樣品中模板的對應關系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關系（y二ax+b汎代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)7代表Ct值\與終點法相較利用Ct值的優(yōu)勢由于Ct值是反映實際PCR反映進程中擴増即將進入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的阻礙，因此利用Ct值判定的起始模板拷貝數(shù)加倍精準重復性也更好。傳統(tǒng)的終點檢測法是在PCR擴増經(jīng)歷了指數(shù)擴増期進入平臺期后利用EB等染料染色來判定擴増產(chǎn)物的多少,從而間接的判定起始拷貝量,這種方式的精準度不高、重復性也不行。以下圖中是96個復孔的實時擴增曲線（完全相同的反映體系、相同的反映protocol.相同的樣品起始濃度），能夠看到Ct值具有專門好的重復性，而終點的熒光信號強度不同達到300個單位。另外采納實時熒光定量PCR還能從方式學上有效的避免PCR實驗中交叉污染的問題。因為熒光定量PCR中模板的擴増與檢測是同時進行的,當實驗完成后即可取得定量結(jié)果，直接拋棄含有大量擴増產(chǎn)物的反映管,完全幸免了傳統(tǒng)方式中掏出擴増產(chǎn)物進行電泳鑒按時擴増產(chǎn)物對實驗室造成二次污染的可能性。二?熒光定量PCR的2類方式（按熒光產(chǎn)生的原理分類）染料法（SYBRGreen法）染料法即利用SYBRGreen分子產(chǎn)生的熒光信號來進行樣品定量。該方式與常規(guī)的PCR類彳以，唯一的區(qū)別是在反映體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長為497nm，發(fā)射波長為520nmo與EB的性能類彳以,SYBRGreen也是一種扁平狀的分子,處于游離狀態(tài)時具有很低的熒光本底,當反映體系中存在dsDNA時,SYBRGreen能特異性的與之結(jié)歸并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)勢：1,無需設計、合成探針,實驗本錢低；2,利用方便,與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。染料法的缺點：1,由于SYBRGreen與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有序列特異性，除與特異性的靶序列擴増產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴増進程中形成的引物二聚體、非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合,從而造成擴増效率的降低、結(jié)果的不準確。因此采納該方式關于引物的設計及實驗條件的優(yōu)化要求很高，確保反映進程中沒有非特異性產(chǎn)物的擴増；2，由于SYBRGreen的上述特點，該方式不能應用于MultiplexQPCR技術。（在一個反映管中同時檢測多個目的基因的表達情形）探針法（以TaqMan探針為例）探針法熒光定量PCR與常規(guī)PCR的不同的地方在于:在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探針（探針本

身具有熒光標記）,該探針依照需要擴增的靶序列設計因此只能與待檢測序列結(jié)合，與染料法相較提高了實驗的特異性。目前市場上的探針要緊種類有：TaqMan、Molecular

Beacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan

探針應用最普遍。TaqMan探針的結(jié)構(gòu)：長度與一般PCR弓I物類似，大約20bp左右。在寧與3’端各標記有一個熒光基團，5’的熒光基團稱為報告基團（Report）,3’的熒光基團稱為淬滅基團（Quencher\1=TaqMan探針的性能：在探針結(jié)構(gòu)完整的情形下用特定的波長激發(fā)報告基團，由于報告基團與淬滅基團的空間位置很近，因此報告基團能夠通過FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)將同意的能量轉(zhuǎn)移至!］淬滅基團，使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量,而報告基團并非發(fā)射特定波長的熒光信TaqMan探針法工作原理：?變性(95°C):模板dsDNA充分解鏈;?復性、延伸、酶切降解（60°C）:1,探針與靶序列結(jié)合；上、下游引物與靶序列結(jié)合；3,上、下游引物在Taq酶的作用下合成互補鏈（5'-3’聚合功能）；4,當上游引物延伸到TaqMan探針的5’端時，延伸不能繼續(xù),現(xiàn)在Taq酶發(fā)揮5’-3'夕卜切功能將探針水解并繼續(xù)向前延伸直至完成互補鏈的合成；將探針水解并繼續(xù)向前延伸直至完成互補鏈的合成；?熒光信號的檢測：由于TaqMan探針被水解,報告基團在受到激發(fā)后不能再通過FRET作用將同意的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團，因此能夠檢測到報告基團特定波長的熒光信號,起始模板濃度越高熒光信號越強。與染料法相較TaqMan探針法的優(yōu)勢：1,實驗的特異性取得了提高；2,對探針的5’端采納不同的熒光標記就能夠夠進行MultiplexQPCR0與染料法相較TaqMan探針法的缺點:1,探針的利用提高了實驗本錢；2,探針的利用需要設計及優(yōu)化。三.確信樣品起始模板拷貝數(shù)的2類方式絕對定量采納絕對定量的方式需要利用標準品（已知起始拷貝數(shù)的樣品）成立標準曲線，成立Ct值與樣品起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)之間的線性關系,從而通過實驗后樣品的Ct值得出起始模板量。標準品的種類：含目的基因的質(zhì)粒（經(jīng)酶切線性化處置,其中的插入片段必需采納與QPCR實驗中相同的引物擴増取得XPCR擴増產(chǎn)物（經(jīng)純化,必需采納與QPCR實驗中相同的引物擴增取得）、化學合成的寡聚核昔酸、cDNA、gDNA等，前2種標準品利用較為普遍。標準品的定量：UVA260、熒光分光光度檢測等。為了使實驗最終取得的Ct值之間具有可比性,必需進行歸一化的處置：1,對各樣品進行細胞計數(shù)，使各樣品的起始細胞數(shù)一致（可操作性不強,尤其是針對組織、腫瘤等樣品）；2,對純化后取得的總RNA進行定量使各樣品進行RT-PCR時加入的RNA用量一致。相對定量與絕對定量不同,相對定量不關切每一個樣品中目的基因表達產(chǎn)物（mRNA）的具體拷貝數(shù)z而關注目的基因在不同的細胞類型、不同的發(fā)育周期等條件下不同的轉(zhuǎn)錄效率,即基因的不同化表達。就硏究目的而論，該方式比絕對定量的應用范圍更普遍、更符合硏究的目的。某目的基因在樣品與對照品間表達不同倍數(shù)的計算公式如下：公式說明：Rel.Quantity:目的基因在樣品與對照品間表達不同的倍數(shù)；GOI:目的基因(GeneofInterest);Norm:內(nèi)參基因(ReferenceGenezNormalizerzHouseKeepingGene)Eff:PCR擴増效率,分子部份為目的基因擴増效率,分母部份為內(nèi)參基因的擴増效率；利用該公式時，需要通過實驗別離確信目的基因與內(nèi)參基因的擴増效率然后代入公式進行計算；若是目的基因與內(nèi)參基因的擴増效率都接近于100%且相差小于5%也可將PCR擴増效率默以為100%,如此公式就簡化為2-AACt0?什么緣故需要設立內(nèi)參基因?若是僅僅比較目的基因的是不能準確反映樣品間目的基因的表達不同的,最主若是受到3個變量的阻礙:1,樣品處置時不同的純化得率；2,RT-PCR進程中不同的逆轉(zhuǎn)錄效率;3,QPCR反映體系中不同的cDNA加入量。由于上述3個變量在樣品間都很難操縱在相同的水平上,因此需要引入內(nèi)參基因來矯正上述變量進行歸一化處置，使得所有樣品目的基因表達水平的比較是在相同的水平上進行的，如此得出的結(jié)果才具有可信性與良好的重復性。（注意：內(nèi)參基因的（1+EffACt）位于分母的位置，進行除法的運算。）?如何選擇內(nèi)參基因？符合什么標準的基因能夠作為內(nèi)參基因？

i=由于上述內(nèi)參基因的用途,因此內(nèi)參基因的選擇必需知足以下3個條件：1,在不同的細胞、組織中具有恒定的表達；2，在不同的細胞周期、發(fā)育周期中具有恒定的表達；3,在不同的實驗狀態(tài)下具有恒定的表達。內(nèi)參基因的—樣小于2（即小于1倍的表達不同），一樣采納的內(nèi)參基因都是一些管家基因，利用最多的為:?-actin.GAPDH、18sRNA等。i=1=需要注意的是：并非傳統(tǒng)意義上的管家基因都能作為內(nèi)參基因，仍是需要與具體的實驗結(jié)合起來綜合考慮。例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明顯的高表達,不能作為內(nèi)參基因。因此在選擇內(nèi)參基因時建議：1,查閱相關文獻；2,設立多個內(nèi)參基因；3,采納表達譜的方式確信理想的內(nèi)參基因。1=?采納Singleplex仍是Multiplex?篇二：實時熒光定量PCR具體實驗步驟以下實驗步驟僅供參考：1樣品RNA的抽提取凍存已裂解的細胞室溫放置5分鐘使其完全溶解。兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動猛烈振蕩管體15秒后,15到30弋孵育2到3分鐘。4弋下lXXrpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為基層的紅色酚氯仿相,中間層和無色水相上層。RNA全數(shù)被分派于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試齊啲60%oRNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30。＜2孵育10分鐘后，于4°C下lXXrpm離心10分鐘。現(xiàn)在離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。RNA清洗移去上清液，每lmITRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少lml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制）,清洗RNA沉淀?；靹蚝?4°CT7000rpm離心5分鐘。RNA干燥警惕吸去大部份乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。溶解RNA沉淀溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40pl用槍反復吹打幾回，使其完全溶解,取得的RNA溶液保留于?80°C待用。2RNA質(zhì)量檢測1）紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液濃度和純度。濃度測定A260下讀值為1表示40pgRNA/ml0樣品RNA濃度(pg/ml)計算公式為:A260x稀釋倍數(shù)x40Mg/ml0具體計算如下:RNA溶于40plDEPC水中，取5ul,1:100稀釋至495訓的TE中,測得A260=0.21RNA濃度二0.21xlOOx40pg/ml二840pg/ml或0.84pg/pl取5ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35pl,剩余RNA總量為：35plx0.84pg/pl=29.4pg純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度z比值范圍1.8到2.102)變性瓊脂糖凝膠電泳測定①制膠lg瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60°C,10ml的10XMOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。lOxMOPS電泳緩沖滋濃度成份0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板，預留加樣孔至少能夠加入25Ml溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的lxMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。②預備RNA樣品取3|jgRNAz加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10pg/ml。加熱至7CTC孵育15分鐘使樣品變性。電泳上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2hz電泳至溟酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。紫外透射光下觀看并拍照28S和18S核糖體RNA的帶超級亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀看到一個更小略微擴散的帶,它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間能夠看到_片彌散的EB染色物質(zhì),可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備進程中若是顯現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面顯現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。3樣品cDNA合成反映體系序號反映物劑量1逆轉(zhuǎn)錄buffer2pl2上游引物0.2pl3下游引物0.2|jldNTP0.1|j|5逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV0.5|jlDEPC水5|jlRNA模版2|jl8整體積lOpI輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70弋干浴3分鐘,掏出后當即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5|jlz37°C水浴60分鐘。掏出后當即95弋干浴3分鐘，取得逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保留于-80°C待用。4梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（p-actin）實時定量PCR①p-actin陽性模板的標準梯度制備陽性模板的濃度為1011,反映前取3pl按10倍稀釋（加水27pl并充分混勻）為1010,依次稀釋至10九、10八、107、10六、10五、104,以備用。②反映體系如下：標準品反映體系序號反映物劑量1SYBRGreen1染料lOpI2陽性模板上游引物F0.5|j|3陽性模板下游引物R0.5pldNTP0.5plTaq酶lpl6陽性模板DNA5|jl7ddH2O32.5pl8整體積50|j|輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。管家基因反映體系：序號反映物劑量1SYBRGreen1染料10pl2內(nèi)參照上游引物F0.5|jl3內(nèi)參照下游引物R0.5pl4dNTP0.5pl5Taq酶lpl6待測樣品cDNA5pl7ddH2032.5pl8整體積50|j|輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反映條件為：93°C2分鐘,然后93°C1分鐘,55°C2分鐘，共40個循環(huán)。5制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板①針對每一需要測量的基因,選擇一確信表達該基因的cDNA模板進行PCR反映。反映體系:序號反映物劑量10xPCR緩沖液2.5ulMgCI2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5uldNTP混合液3ulTaq聚合酶1ulcDNA1ul8加水至整體積為25ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個PCR循環(huán)（94°C1分鐘;55°C1分鐘;72°C1分鐘）；72oC延伸5分鐘。②PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，漠化乙錠染色,檢測PCR產(chǎn)物是不是為單一特異性擴増條帶。③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋：將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋：設定PCR產(chǎn)物濃度為1X1010,依次稀釋至10九、10107、10六、10五、104幾個濃度梯度。6待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR所有cDNA樣品別離配置實時定量PCR反映體系。體系配置如下：序號反映物劑量1SYBRGvenl染料10ul2上游引物lul3下游引物luldNTPlulTaq聚合酶2ul6待測樣品cDNA5ul7ddH2O30ul8整體積50ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。將配制好的PCR反映溶液置于RealtimePCR儀上進行PCR擴増反映。反映條件為：93°C2分鐘預變性，然后按93°C1分鐘，55°C1分鐘z72°C1分鐘,共40做個循環(huán),最后72°C7分鐘延伸。7實時定量PCR利用引物列表引物設計軟件：PrimerPremier5.0z并遵循以下原那么：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間幸免形成穩(wěn)固的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反映（即錯配）。8電泳各樣品的目的基因和管家基因別離進行RealtimePCR反映。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView?染色,檢測PCR產(chǎn)物是不是為單一特異性擴増條帶。篇三：生物實驗4實時定量PCR實驗報告實驗四定量PCR擴増姓名：李宗翰專業(yè)：環(huán)境工程學號:1432999同組人姓名：劉雪飛—、實驗目的溫習定量PCR原理,熟悉絕對定量的操作流程二實驗原理實時熒光定量PCR是在PCR反映體系中加入熒光基團,利用熒光信號積存實時監(jiān)測整PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方式。在PCR擴増的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析三、實驗儀器及材料realtimePCR儀（ABI7500,RotorGene3000）,微量移液器，Tip頭，0.2ml光學薄壁管，8聯(lián)PCR管，1.5ml離心管zSYBRMix,引物及108copy/ul標準品四、實驗步驟—、標準樣品稀釋：取4個1.5ml的離心管,寫上標記107z106,105,104,向每管加入90|j|ddH2Oz取lOpI108copy/ul的標樣加入到107管中，充分混勻后，從管中取lOpI107copy/ul的液體到106管中。按上述操作依次稀釋，取得5個倍數(shù)的標準樣品。注意,每次稀釋都要換Tip頭。二配制預混液：取口9plddH2O.7pl引物4204f、7訓引物4448r和7plRox到裝有175|j|SYBRMix液的1.5ml離心管中，混勻。3、分裝預混液取7個小離心管另U離標記10八、107、10六、10五、104、UNK（未知樣）、NTC（陰性對照）。向其中別離加入42pl預混液和4.7|jl模板（1?5號加標樣、6號加未知樣、7號加等量ddH20），混勻。4、戴上手套取兩個8聯(lián)管,并排放置管架上。別離月上述樣品20卩1至第1-7管中（第8管空出）,每一個樣品兩個重復，共14個樣品。將加好樣的8聯(lián)管振蕩。五、設置分析儀參數(shù)如下：95°C3min;95°C15s+60°C40s為f盾環(huán)，循環(huán)次數(shù)40,融解曲線溫度范圍60?95弋。振蕩好的樣品進機進行PCR擴增。六、擴増后利用軟件分析CT值及未知樣的定量結(jié)果。五、實驗結(jié)果與討論_、實驗結(jié)果如何？試分析。答：實驗結(jié)果及分析如下。（1X實驗具體數(shù)據(jù)見下表QuantityWellTaskCtCtMeanCtSDQuantityMeanQuantitySDCtThresholdAlSTANDARD8.24888.25270.0055100000000A2STANDARD8.25658.25270.0055100000000BlSTANDARD11.389311.65980.3825100000000.3825B2STANDARD11.930311.65980.382510000000ClSTANDARD15.329214.96680.51261000000C2STANDARD14.604314.96680.51261000000D1100000STANDARD19.491219.30800.2590D2100000STANDARD19.124919.30800.2590ElSTANDARD22.538522.41960.168110000E2STANDARD22.300722.41960.168110000FlUNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.625F2UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.625G1NTC32.5329G2NTC32.9549其中,A-E為標準樣品，F(xiàn)為位置樣品，G為陰性對照。每一個樣品做兩個平行