現(xiàn)代生化儀器分析電泳技術(shù)電泳的基本原理電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。電泳的分類顯微電泳等電聚焦電泳等速電泳密度梯度電泳電泳自由電泳（無支持體）

區(qū)帶電泳（有支持體）濾紙電泳（常壓及高壓）薄層電泳（薄膜及薄板）凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學性質(zhì)穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳和雙向電泳等類型。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效應，由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學研究中常用的技術(shù)，可用于分離，鑒定和純化DNA或RNA片段。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下，有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。分離不同大小DNA片段的

合適瓊脂糖凝膠濃度在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidiumbromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。電泳緩沖液

TAE：乙酸鹽緩沖液TBE：硼酸鹽緩沖液TPE：磷酸鹽緩沖液電泳裝置

StructureandFunctionAnalysisofNucleocapsidProteinofTomatoSpottedWiltVirusInteractingwithRNAUsingHomologyModeling

研究背景：對于許多病毒的蛋白來說，很難得到它們的晶體結(jié)構(gòu)，因此這就對分析病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了困難。這些病毒中就包括番茄斑萎病毒（TSWV）結(jié)果：使用同源建模的方法，通過實驗分析論證，得出了病毒粒子的RNA與病毒核衣殼蛋白的結(jié)合位點，同時發(fā)現(xiàn)了TSWV的核衣殼蛋白可以保護RNA免遭RNA酶的分解這一特點。結(jié)論：同源建模為TSWV核衣殼蛋白的功能以及與RNA相互作用的分析提供了基礎(chǔ)依據(jù)。意義：同源建模的方法也可應用于其他植物病毒。Abstract&Introduction：TSWV病毒粒子的核糖核蛋白（RNP）中包裹的RNA為病毒基因的轉(zhuǎn)錄和基因組的復制提供了模板（而不是裸露的RNA），在核糖核蛋白包裹基因組RNA的過程中，TSWV的結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白（N）發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。然而，很少有人知道該過程的分子機制，N與基因組RNA是如何相互作用的呢？在這項研究中，我們證實了TSWV的核衣殼蛋白會形成一系列高度有序的低聚物。在對這些低聚物與基因組ＲＮＡ的結(jié)合行為的分析中，揭示了這些低聚物與ＲＮＡ的結(jié)合沒有特異性，各種類型的Ｎ低聚物都可與ＲＮＡ結(jié)合。為了更好的確定與ＲＮＡ作用的Ｎ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，我們采用同源建模的方法，構(gòu)建了Ｎ和Ｎ－ＲＮＡ復合物的同源模型?；趯@些同源模型的分析，我們就可以預測出Ｎ蛋白的結(jié)構(gòu)，同時發(fā)現(xiàn)在該結(jié)構(gòu)的表面存在大量的帶正電荷的極性氨基酸殘基，并且證實這些對Ｎ蛋白與ＲＮＡ的結(jié)合是至關(guān)重要的另外對得出的Ｎ－ＲＮＡ復合物模擬結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，ＲＮＡ牢牢嵌入了這個復合物中。因此，由于Ｎ－RNA復合物的形成可以使病毒的RNA抵抗RAN酶的消化質(zhì)粒的構(gòu)建在該實驗中共構(gòu)建了三種質(zhì)粒。第一種是表達野生型TSWV核衣殼蛋白（N）的質(zhì)粒。使用的質(zhì)粒載體是pET28a，該質(zhì)粒上帶有多聚組氨酸標簽（His6Tag），有利于后期蛋白的分離純化。第二種是表達突變型TSWV核衣殼蛋白（N)的質(zhì)粒。表達出來的突變型N是通過定點突變實現(xiàn)的。這種蛋白為后面分析RNA的結(jié)合位點提供材料。第三種是克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)錄的RNA用于探針的制備。使用的質(zhì)粒是pMD19，該質(zhì)粒帶有TSWV末端序列，并且?guī)в芯G色熒光蛋白標記基因。蛋白表達和純化構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli（DE3）中進行表達，將10ml過夜培養(yǎng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)移到1L的容器中在37攝氏度下繼續(xù)培養(yǎng)，直到600nm處的光密度值達到0.6為止。加入0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

IPTG）誘導蛋白的表達。需要在25度下過夜培養(yǎng)。溶菌酶處理培養(yǎng)液，然后在冰上用超聲波破碎培養(yǎng)液中的細胞，在12800Xg的離心力下離心1小時。取上清液，采用NI-NTA親和層析法純化蛋白檢驗重組蛋白準確表達將純化得到的重組TSWVN蛋白進行SDS，得到下圖結(jié)果。從圖中可以得出重組蛋白的分子量大約在25kDa35kDa之間。然后再通過蛋白免疫印跡同樣檢測到了重組蛋白。因此可以確定重組蛋白得到準確表達。重組TSWVN蛋白可以與E.coli的胞內(nèi)RNA結(jié)合當紫外分光光度計測定純化的蛋白的濃度是發(fā)現(xiàn)，純化的TSWVN蛋白的OD260/OD280的值上升到了1.7，這說明TSWVN蛋白結(jié)合了E.coli的內(nèi)源RNA。為了證明這一推論，我們將得到的純化的蛋白做變性處理，使其將結(jié)合的RNA釋放出來。同時，提取了在相同品系中表達的重組麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）作為對照。將兩種結(jié)合蛋白變性處理后，加到經(jīng)過EB染色的1%的瓊脂糖凝膠上檢測RNA。觀察結(jié)果圖得出，在N蛋白的區(qū)域很容易檢測到RNA，而MBP的區(qū)域沒有檢測到RNA存在。因此得出結(jié)論：TSWVN蛋白可以與E.coli的內(nèi)源RNA非特異的結(jié)合。TSWVN蛋白可以形成不同形式的低聚物為了證實N蛋白形成低聚物，我們進行了濃度不連續(xù)非變形的凝膠電泳（即BN）。這種電泳使用的膠為非變性膠，可以使蛋白復合物在處于活性狀態(tài)下得到分離。將得到的純化N蛋白進行BN。得到下圖結(jié)果。從左側(cè)的電泳圖中可以看出，TSWVN蛋白形成了一系列的不同類型的低聚物。有31kDa的單體，62kDa的二聚體，93kDa的三聚體，124kDa的四聚體，155kDa的五聚體。由于做電泳使用的蛋白是用Ni-NTA純化得到的蛋白，所以這些蛋白中帶有組氨酸標簽。為了排除低聚物的形成是由于這些標簽引起的這一可能。我們把帶有標簽的蛋白的N末端的組氨酸標簽切去得到不帶有標簽的蛋白。對這些蛋白進行相同的電泳分析，得到如下圖的結(jié)果。觀察電泳圖發(fā)現(xiàn)形成的各類低聚物條帶與帶有標簽蛋白的電泳條帶是一樣的。同樣形成了各種類型的低聚物。這就說明N蛋白可以通過自身的交聯(lián)形成各種類型的低聚物。為了更進一步的證實以上的結(jié)論，我們在純化的蛋白中加入了交聯(lián)劑（戊二醛）。然后在5%-20%SDS分離，并用考馬斯亮藍染色。從電泳圖中很明顯的可以發(fā)現(xiàn)，隨著交聯(lián)劑的不斷增加，各個類型低聚物的條帶的顏色不斷加深。這就又證實了以上的結(jié)論：TSWVN蛋白可以形成一系列的高度有序的低聚物。TSWVN蛋白的低聚物與RNA的結(jié)合從以上的實驗中我們已經(jīng)確定N蛋白形成了不同類型的低聚物，接下來研究這些低聚物與RNA分子的結(jié)合，與RNA的結(jié)合是否與低聚物的形成有一定的聯(lián)系。由于從E.Coli中表達出的重組N蛋白可以與E.Coli的RNA非特異結(jié)合，所以在研究N蛋白與TSWV的RNA的結(jié)合之前需要除去重組N蛋白上結(jié)合的E.ColiRNA。使用PEI（聚乙烯亞胺）處理得到的N蛋白，然后分別對PEI處理的蛋白和未經(jīng)處理的蛋白進行RNA凝膠電泳分析。得到下圖結(jié)果：很容易從圖中觀察到在未經(jīng)處理的N蛋白中檢測到了RNA，而經(jīng)過處理的蛋白中沒有RNA。所以經(jīng)過PEI的處理重組蛋白上結(jié)合的E.ColiRNA會被沉淀過濾掉。接下來為了確定N蛋白結(jié)合RNA是否是形成蛋白低聚物所必須的，我們將經(jīng)過PEI處理的蛋白和未經(jīng)PEI處理的蛋白分別進行BN。得到了如下圖所示的電泳圖譜：從圖中可以看出經(jīng)PEI處理和未經(jīng)處理的蛋白產(chǎn)生了相似的條帶，都形成了一系列的低聚物。結(jié)合上面的實驗證實N蛋白低聚物的形成與是否結(jié)合有RNA無關(guān)分析N蛋白與RNA的結(jié)合作用。將一定量的PEI處理過的N蛋白與未標記的RNA（ssRNA，帶有TSWV末端序列）混合，并逐漸增加RNA的量，然后將混合物在不連續(xù)的非變性凝膠中電泳。同樣的樣品也進行了變性的SDS。ssRNA的量在1-10微克時，所形成的復合物的類型并沒有發(fā)生變化，但是當繼續(xù)增加ssRNA的量在20-80微克時，發(fā)現(xiàn)各種類型的低聚物消失了。低聚物的消失說明了各個類型的低聚物結(jié)合了更多的ssRNA形成了更大的復合物。分析各個樣品的SDS結(jié)果可以說明低聚物的消失不是由蛋白酶的降解造成的。TSWVN蛋白可以結(jié)合E.Coli的內(nèi)源RNA，我們利用它這一特點來論證N蛋白形成的各個類型的低聚物都可以與RNA結(jié)合。將從大腸桿菌中分離純化出來的N蛋白，在4%-16%的藍色的非變性的凝膠中電泳分離加RNA結(jié)合緩沖液（95%的甲酰胺）使蛋白復合中的RNA釋放出來100度沸水浴5分鐘，在1%瓊脂糖凝膠（含有EB）中電泳，紫外光下照射觀察膠回收，破碎膠，加PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）洗脫從瓊脂糖電泳圖譜中可以看出，在1,2,3,4區(qū)域內(nèi)均檢測到了RNA，所以可以得出結(jié)論，TSWVN蛋白所形成的不同形式的低聚物均可與RNA結(jié)合。構(gòu)建TSWVN和N-RNA復合物的同源模型

先前的研究已經(jīng)證實，TSWVN的大約一半的氨基和羧基與RNA的結(jié)合有關(guān)。然而，由于與RNA結(jié)合有關(guān)的那些帶正電的氨基酸殘基數(shù)量大，而且分布在整個N的肽鏈上，因此要確定N蛋白與RNA的結(jié)合位點是相當有難度的。為了克服這個難題，我們直接利用同源建模的方法，模擬出N蛋白以及N-RNA復合物的3D結(jié)構(gòu)，通過直接的觀測其結(jié)構(gòu)來確定到底是哪幾個氨基酸殘基在RNA的結(jié)合中起作用。然后再通過定點突變，進行反向驗證。突變由觀察得來的結(jié)合位點，看看N蛋白與RNA的結(jié)合能力是否發(fā)生改變，從而確定是否是該位點在結(jié)合中起作用，達到確定結(jié)合位點的目的。上圖便是通過I-TASSER程序模擬出來的TSWV-N的結(jié)構(gòu)，從圖A中可以看出這個結(jié)構(gòu)由四部分組成，分別是N-末端臂，C-末端臂，N端結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域。圖B是圖A旋轉(zhuǎn)90度的效果圖。N端和C端的臂可能與蛋白低聚物的形成有關(guān)。N端和C端結(jié)構(gòu)域形成了N蛋白的核心結(jié)構(gòu)。N端和C端形成了一個裂縫可能與RNA的結(jié)合有關(guān)為了進一步驗證模擬的結(jié)構(gòu)的準確性，我們將與TSWV病毒同科的其他布尼亞病毒的N結(jié)構(gòu)進行比對，將二者重疊，可以發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)構(gòu)出C和N端的臂不同外，主要的核心結(jié)構(gòu)域非常相似而且重疊起來。這就證明了模擬結(jié)構(gòu)的準確性。模擬一條有11個核苷酸的RNA鏈與N蛋白結(jié)合，得到E圖的N-RNA復合物的結(jié)構(gòu)。和明顯看出，RNA鏈牢牢的嵌入核心結(jié)構(gòu)域形成的裂縫里，被兩側(cè)的蛋白包裹。對非結(jié)構(gòu)的表面電荷進行分析，得到F圖，在RNA與蛋白的結(jié)合的裂縫的區(qū)域存在大量的正電荷（藍色區(qū)域）。確定TSWVN蛋白上的RNA結(jié)合位點通過對TSWVN蛋白的模擬結(jié)構(gòu)的分析，可以推測N蛋白裂縫區(qū)域的表面正電荷與RNA的結(jié)合有關(guān)。為了確定N蛋白具體哪一個氨基酸殘基與RNA的結(jié)合相關(guān)，我們從GenBank中調(diào)出20種番茄斑萎病毒N蛋白的氨基酸序列進行比對。通過比對發(fā)現(xiàn)一些帶正電和極性氨基酸都是保守序列，并且這些氨基酸殘基都位于裂縫的區(qū)域。把這些保守的，帶正電的以及極性的氨基酸作為突變位點進行定點突變。將這些氨基酸突變成丙氨酸。選取十個突變位點進行丙氨酸替換。R60A,K65A/K68A,K81A,R94A/R95A,K183A/Y184A,andK192A/T195A。在E.Coli中表達出所有的突變體蛋白，用PEI除去E.Coli的內(nèi)源RNA，然后用Ni-NAT純化。純化出的蛋白在藍色的4%-16%非變性膠中電泳，各種類型的低聚物得到分離。如下圖所示：野生型的和突變型的蛋白形成了相似的條帶，說明通過突變對N蛋白低聚物的形成并未產(chǎn)生實質(zhì)的影響為了確定各種突變的蛋白是否都對與RNA的結(jié)合能力產(chǎn)生了影響，我們分別測定了突變蛋白RNA復合物的解離常數(shù)。首先從凝膠中回收各種突變蛋白，將蛋白與一定量的RNA探針混合（DIG標記且包含TSWV末端序列），使二者結(jié)合形成復合物，采用濾膜結(jié)合法（FilterBindingassay)測定解離常數(shù)。結(jié)果如下圖所示：從右側(cè)結(jié)果可以看出，R60A，K65A/K68A,K81A,K192A/T195A這幾個位點的突變的蛋白復合物的解離常數(shù)與野生型相差不大，說明這些突變并未影響蛋白與RNA的結(jié)合。而K183A/Y184A,R94A/R95A的突變是解離常數(shù)明顯增大，也就是蛋白與RNA的親和力明顯減小。也說明蛋白與RNA的結(jié)合與這幾個位點有關(guān)。為了進一步證實以上的結(jié)論，我們對以上的兩種突變體進行凝膠遷移分析（