植物基因工程中的常用啟動(dòng)子_3231植物基因工程中的常用啟動(dòng)子_3231植物基因工程中的常用啟動(dòng)子植物基因工程中常用的啟動(dòng)子按其作用方式及功能可分為三類：組成型啟動(dòng)子(constitutivepromoter)、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(induciblepromoter)和組織特異性啟動(dòng)子(tissue-specificpromoter)。這種分類大體上反映了它們各自的特點(diǎn),但在某些情況下，一種類型的啟動(dòng)子往往兼有其它類型啟動(dòng)子的特性。1組成型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子在所有組織中都啟動(dòng)基因表達(dá)，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時(shí)空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量也是相對(duì)恒定的。它包括異源和內(nèi)源組成型啟動(dòng)子兩類。植物基因工程中應(yīng)用的異源組成型啟動(dòng)子主要有CaMV35S啟動(dòng)子(來源于煙草花葉病毒基因)，能在大部分植物中對(duì)異源基因進(jìn)行啟動(dòng)表達(dá)，完整的CaMV35S啟動(dòng)子是植物基因工程中應(yīng)用最為廣泛的組成型啟動(dòng)子之一，如在馬鈴薯、擬南芥、煙草、蘑菇、毛白楊等植物中的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。常用的還有來自農(nóng)桿菌的Nos和Ocs啟動(dòng)子。內(nèi)源啟動(dòng)子主要有水稻肌動(dòng)蛋白(actin)和玉米泛素(ubiquitin)基因的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子可以更有效地驅(qū)動(dòng)外源基因在單子葉植物中的表達(dá)。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶8亞基基因和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也取得了很好的表達(dá)效果。用這些啟動(dòng)子代替CaMV35S啟動(dòng)子，可以更有效地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。組成型啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于雙子葉植物、單子葉植物以及真菌等的基因工程中。但是由于組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在植物各組織中均有表達(dá)，應(yīng)用中逐漸暴露出一些問題。例如外源基因在整株植物中表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有的代謝平衡，有些產(chǎn)物對(duì)植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡(karlowakietal.,2003;Ehasanietal.,2003;Miyaoetal.,2003)。另外，重復(fù)使用同一種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的外卜源基因可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象(Kumpatlaetal.,1998)，因此，人們尋找更為有效的組織、器官特異性啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，以更好地調(diào)控植物基因表達(dá)。2特異性啟動(dòng)子特異性啟動(dòng)子可分為兩類，一是受誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，能對(duì)外界的物質(zhì)如病原物、化學(xué)物質(zhì)或逆境作出反應(yīng)，啟動(dòng)植物體內(nèi)相應(yīng)的生理生化過程。二是組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子，使基因在特定的組織中表達(dá)。特異性啟動(dòng)子避免了基因過量表達(dá)對(duì)植物體的傷害，同時(shí)可避免外源基因在食用部位表達(dá)，解決了食品安全性問題。特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。(1)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。他們有以下共同特點(diǎn)：?[3][4][5]啟動(dòng)子的活化受物理或化學(xué)信號(hào)的誘導(dǎo)；？具增強(qiáng)子、沉默子或類似功能的序列結(jié)構(gòu)；？感受特異性誘導(dǎo)的序列都有明顯的專一性；？一部分該類型的啟動(dòng)子同時(shí)具組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)；？該類啟動(dòng)子常以誘導(dǎo)信號(hào)命名，可分為光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子，如rbcS、cab基因啟動(dòng)子；熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子如大豆的Gmhsp17。3-B啟動(dòng)子；創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子如水稻的RCH8啟動(dòng)子；激素誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子如綠豆的VR-ACS6啟動(dòng)子；真菌和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子如馬鈴薯P69B啟動(dòng)子等(王關(guān)林和方宏筠，1998)。(2)組織特異性啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)制目前已進(jìn)行了深入的研究，基因的上游存在著調(diào)控序列，啟動(dòng)子除具有一般的結(jié)構(gòu)外，通常還有一些調(diào)控特異表達(dá)的元件。在組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控下，基因的表達(dá)通常只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。根特異性啟動(dòng)子的研究Keller等1989年分離了來自煙草的富含羥脯氨酸的糖蛋白hrgp基因，這個(gè)基因所編碼的蛋白用來強(qiáng)化新形成側(cè)根的細(xì)胞壁，在根中特異表達(dá)；Keller等1991年又發(fā)現(xiàn)一個(gè)法國(guó)菜豆胞壁蛋白基因富含甘氨酸蛋白grp基因啟動(dòng)子是根管束組織特異表達(dá)的，在其-96上一頁[3][4][5]?-76bp處有一個(gè)特異性表達(dá)元件負(fù)責(zé)根尖膨大維管分化區(qū)組織帶中的主要表達(dá)。莖桿和葉片特異性啟動(dòng)子的研究Kyozuka等(1993)研究了水稻和番茄的rbcS基因啟動(dòng)子在水稻中的啟動(dòng)活性，證明了它們都能驅(qū)動(dòng)gus基因在葉片和莖桿中特異表達(dá)。IrisMeier等（1995）研究番茄rbcS基因家族也發(fā)現(xiàn)rbcS3A在葉片和莖桿中特異表達(dá)。Sheng等研究水稻cab基因啟動(dòng)子，證明了cab基因啟動(dòng)子僅在綠色組織中啟動(dòng)活性。大多數(shù)葉片和莖桿特異的啟動(dòng)子同時(shí)也是受光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。生殖器官特異性啟動(dòng)子的研究Mariani等將煙草花藥絨氈層特異表達(dá)基因啟動(dòng)子TA29與核酸酶基因Barnase、RnaseT融合后轉(zhuǎn)化植物核酸酶基因在花藥中特異表達(dá)，破壞絨氈層，獲得雄性不育煙草和油菜，開創(chuàng)了基因工程創(chuàng)造雄性不育系的先河，至今已在煙草、玉米、油菜、擬南芥、水稻等植物上獲得成功。Annadana等克隆了菊花UEP1啟動(dòng)子并與4個(gè)異源啟動(dòng)子（矮牽牛的chs2A和EPF225,擬南芥的CER6以及馬鈴薯的PMC）比較發(fā)現(xiàn)：UEP1啟動(dòng)子在傘形花序和花盤小花的花瓣中表達(dá)量最高，緊接著是CER6上一頁[3][4][5]和EPF225啟動(dòng)子，在傘形花序小花中UEP1啟動(dòng)子的表達(dá)量是CaMV35S啟動(dòng)子的50倍。維管束特異性啟動(dòng)子的研究目前發(fā)現(xiàn)的能夠定位于維管組織的啟動(dòng)子根據(jù)其來源基本可以分為兩種：一是植物本身特異性表達(dá)蛋白的基因的啟動(dòng)子，如能在韌皮部特異表達(dá)的玉米蔗糖合成酶基因Sh1啟動(dòng)子，谷氨酰胺合成酶基因GS34啟動(dòng)子；二是能特異性侵染植物維管組織的病毒基因啟動(dòng)子（劉昱輝和賈士榮，2003）。韌皮部特異性啟動(dòng)子的研究韌皮部特異性啟動(dòng)子區(qū)別于其它類型啟動(dòng)子的一個(gè)顯著特點(diǎn)是在該類啟動(dòng)子序列中存在一段與啟動(dòng)子的韌皮部特異性表達(dá)有關(guān)的序列。將幾種韌皮部特異性啟動(dòng)子的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在距TATAbox上游的不同位置，有一個(gè)13bp的保守序列T/ATAAGT/AACGAAT/CC/A，它可能與韌皮部特異表達(dá)有關(guān)，除此保守序列外，啟動(dòng)子中可能還存在其它的決定韌皮部特異性的元件，例如在對(duì)楊樹樹皮貯藏蛋白(barkstorageprotein,BSP)基因、筍瓜韌皮部蛋白2基因(PP2)及竹節(jié)花黃斑駁病毒(commelinayellowmottlevimsCoYMV)啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，前兩者分別存在特征序列GCTATG和CGTATG,推測(cè)(G/C)(G/C)TATG序列可能也與啟動(dòng)子的韌皮部特異性及啟動(dòng)子的活性密切相關(guān)(張海利和呂淑霞，2003)。蔣浩等將筍瓜韌皮部蛋白(phloemprotein)PP2楊樹樹皮儲(chǔ)藏蛋白BSP啟動(dòng)子通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，首次用轉(zhuǎn)基因植物證明筍瓜PP2上一頁[3][4][5]基因啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)外源基因在異源植物韌皮部及分生組織中特異性表達(dá)。種子和果實(shí)中特異性啟動(dòng)子的研究李麗等利用PCR技術(shù)從油菜基因組DNA中分離napinB啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子為種子特異表達(dá)。通過比較發(fā)現(xiàn)，不同napinB基因啟動(dòng)子5’端起始密碼子前300bp中相當(dāng)一部分序列是保守的，越靠近起始密碼子，同源性越高，甚至某些區(qū)段核苷酸序列高度一致。由此可見，napinB基因啟動(dòng)子間具普遍同源性。napinB啟動(dòng)子5’上游區(qū)域與以往發(fā)表的napin啟動(dòng)子編碼區(qū)比較表明，一些序列在進(jìn)化上具有保守性，可能影響基因調(diào)控并與種子特異表達(dá)密切相關(guān)。2A12是番茄中另一種果實(shí)特異性啟動(dòng)子。毛自朝等(2002)用PCR方法獲得了番茄果實(shí)