-1-細胞復蘇及

細胞判別與計數(shù)第1頁-2-什么是傳代培養(yǎng)？細胞傳代應注意哪些問題?細胞胞傳代培養(yǎng)目標是什么?貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不一樣?怎樣預計是否傳代和傳代方式?細胞凍存應注意問題。討論第2頁-3-試驗目標掌握細胞復蘇基本方法掌握用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)方法。學習死活細胞判別方法第3頁-4-一、細胞復蘇原理：是以一定復溫速率將凍存培養(yǎng)物恢復到常溫過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)器官都能夠進行凍存，并在適當條件下復蘇。復蘇細胞標準：快溶。使培養(yǎng)物能快速經(jīng)過對細胞有損害－5～0℃攝氏度區(qū)域，細胞仍能生長，活力受損不大。第4頁-5-細胞復蘇操作步驟準備一個茶缸或1000ml燒壞，

內裝2/3杯40℃溫水。從液氮中取出凍存管、快速置

于溫水中并不停攪動。使凍存

管中凍存物在1分鐘之內融化。第5頁-6-將凍存管放入離心管中800rpm離心10分鐘，取出凍存管拿入超凈臺中，75%酒精消毒管口，打開凍存管，棄掉凍存液，沉淀加4ml培養(yǎng)基后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。細胞復蘇后，第二天換液去除漂浮未貼壁細胞，細胞長滿后傳代。經(jīng)傳代一至二次后，細胞即可恢復正常狀態(tài)。另取9滴細胞懸液加入1滴0.4%臺盼藍染色,取80μl細胞液鏡下觀察活力。第6頁細胞計數(shù)方法：血球計數(shù)板和xxx。血球計數(shù)板：由一塊長約7.5cm，寬3.5cm厚玻璃制成。計數(shù)室邊長為1mm，中間平臺下陷0.1mm，蓋上蓋片后計數(shù)室容積為0.1mm3。所以，可依據(jù)在顯微鏡下觀察到細胞數(shù)目，換算成單位體積中細胞數(shù)量。-7-細胞計數(shù)與死細胞判別第7頁-8-按以下方式計算細胞濃度：細胞計數(shù)標準：細胞壓格計上線不計下，計左不計右，如有少許兩個以上細胞按一個細胞計數(shù)，如超出10%說明消化不充分。4個大方格中細胞數(shù)4×104×稀釋倍數(shù)=細胞數(shù)/ml懸液第8頁-9-試驗步驟檢驗記數(shù)板：在正式計數(shù)前，先用顯微鏡檢驗記數(shù)板計數(shù)室，看其是否沾有雜質或干枯菌體。若有污物，則需作以下幾步清洗：擦洗用藥棉蘸取95%酒精，輕輕擦洗計數(shù)板計數(shù)室。沖洗用蒸餾水沖洗計數(shù)板，并用毛邊紙吸干其上水分

注意：勿用內火焰來烤干）最終用擦鏡紙揩潔凈。鏡檢鏡檢清洗后計數(shù)板，直至計數(shù)室無污物時，才可用于細胞計數(shù)。加樣：先將蓋玻片安放在計數(shù)室上面，然后搖勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細胞懸液，連續(xù)2~3次，直至充滿計數(shù)板和蓋玻片間空隙。第9頁-10-計數(shù)：將加好樣品記數(shù)板置于顯微鏡載物臺中央，然后按以下步驟操作：找計數(shù)室先在低倍顯微鏡下尋找計數(shù)板上大方格網(wǎng)位置。尋找時顯微鏡光圈要適當縮小，使視野偏暗。然后順著大方格線，移動計數(shù)板，使計數(shù)室位于視野中間。轉高倍鏡轉至高倍鏡后，適當調整光度，使細胞和計數(shù)室線條均清楚為止。然后將計數(shù)室一角中格移至視野中。計數(shù)計算計數(shù)板四角大格內細胞數(shù)，壓線者只計算左側和上方，右和下不計算在內。清洗計數(shù)完成后，記數(shù)板先用95%酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最終用擦鏡紙揩潔凈。細胞存活率＝(細胞總數(shù)－藍色細胞數(shù))/細胞總數(shù)X100%

第10頁-11-注意事項加液時勿使液體漫過蓋玻片或出現(xiàn)氣泡。鏡下計數(shù)，有時偶然有兩個以上細胞組成細胞團，應按單個細胞計算。如細胞團占10%以上，說明消化不充分，細胞數(shù)少于20個/平方毫米或多于50個/平方毫米時，均說明稀釋不妥，需重新置備細胞懸液，再重新記數(shù)。染色標本在15分鐘內檢驗計數(shù)，因為臺盼蘭染液能夠快速地使死細胞染上藍色，延長時間活細胞也將著色，用此方法來分辨死活細胞。第11頁常見細胞污染判別假如是細菌污染，應該很快培基就渾濁了，常見為顯著或不顯著成串狀，生長很快，培養(yǎng)基很快變得似泥沙狀混濁，黑點移動速度非常快。假如是真菌感染，尤其是早期污染，在低倍鏡下能夠看到小黑點，尤其是成團小黑點，要尤其注意。假如無法確定，就換高倍鏡，假如是死細胞或細胞碎片，高倍鏡下就能夠分辨，而真菌高倍鏡下依然是小黑點。-12-第12頁判別細胞污染方法-13-慣用方法基本操作優(yōu)缺點連續(xù)培養(yǎng)觀察法把疑似培養(yǎng)物單獨標示出來，繼續(xù)培養(yǎng)，24或48小時后再進行大致和鏡下觀察，對比混濁度改變優(yōu)：穩(wěn)妥、不輕易誤判和漏判；缺：耗時、輕易耽擱細胞換液或傳代以及發(fā)放時機取樣培養(yǎng)或涂片法經(jīng)過無菌操作取出部分培養(yǎng)物進行菌培養(yǎng)，或取出進行革蘭氏染色鏡下識別優(yōu)：客觀、能夠識別一些污染類型，利于排查缺：相對繁瑣，易在操作中引入新污染、存在一定假陽性或假陰性直接鏡下識別法利用高倍鏡（400倍）對疑似污染培養(yǎng)物進行觀察，從黑點分布、運動特征、外觀形態(tài)綜合判斷優(yōu)：高效、無須對培養(yǎng)物進行額外操作缺：需要豐富經(jīng)驗，主觀性強，有一定誤判率第13頁-14-未被污染正常培養(yǎng)細胞第14頁-15-培養(yǎng)液泥沙樣改變，細胞皺縮。未見顯著鏈條樣菌類或長桿菌。第15頁-16-第16頁-17-