微小態(tài)勢(shì)性微球藻溶血活性的提取及初步分析

1溶血毒素及溶血活性小羅內(nèi)河是海水和自然水體中常見的裸甲藻種類。在傳統(tǒng)的顯微鏡試驗(yàn)中，它被視為另一種常見的有毒海生海藻，因此在監(jiān)測(cè)和研究赤潮時(shí)往往被忽視。該藻于20世紀(jì)50年代在南非首次被發(fā)現(xiàn)后,在南卡羅萊納州的海水澄清池、美國切薩皮克海灣和馬里蘭州海灣等多處發(fā)生過大規(guī)模赤潮,造成魚類大量死亡,文獻(xiàn)同時(shí)指出魚類致死的主要原因是該藻分泌的溶血毒素使魚的鰓部發(fā)生溶血現(xiàn)象,導(dǎo)致呼吸受阻窒息而死。國內(nèi),微小卡羅藻曾于2003年4月在香港水域形成高密度赤潮,但并未見到相關(guān)魚類死亡的報(bào)道。2005年,在浙江海區(qū)米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)赤潮水樣中也檢測(cè)到該藻。目前,我國對(duì)于微小卡羅藻溶血毒素的生物化學(xué)認(rèn)識(shí),包括溶血毒素的化學(xué)性質(zhì)、主要種類以及溶血強(qiáng)度等都尚未見報(bào)道。在溶血毒素生成特征方面。許多赤潮藻都有其特定的產(chǎn)毒時(shí)期段,如Akiko等發(fā)現(xiàn)Alexandriumtaylory對(duì)數(shù)生長期時(shí)開始分泌溶血毒素,隨后分泌量逐漸增加,即使在衰亡期仍能分泌溶血毒素。球形棕囊藻在對(duì)數(shù)生長期并未表現(xiàn)出溶血活性,但進(jìn)入平穩(wěn)期和衰亡期呈現(xiàn)出一定的溶血活性,并于衰亡期達(dá)到最強(qiáng)。本文研究的微小卡羅藻具有溶血毒已經(jīng)確證,但其在不同生長階段的產(chǎn)毒情況還是未知,并且有報(bào)道指出該藻藻液溶血活性時(shí)有時(shí)無,這就有必要對(duì)該藻整個(gè)生長周期進(jìn)行溶血活性檢測(cè)。在溶血物質(zhì)研究方面,Place等從美國切薩皮克海灣中的微小卡羅藻中分離獲得了幾種有毒化合物類群,被稱作Karlotoxins,這是一類具有魚毒性、溶血毒性和細(xì)胞毒性的化合物,部分提取方法和毒素應(yīng)用正在美國形成專利。但是,在其專利中并沒有得出明確的化合物結(jié)構(gòu),因此對(duì)其毒素的結(jié)構(gòu)研究尚待深入。本文對(duì)微小卡羅藻溶血活性的生長期特征及其溶血毒素的種類進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究該藻溶血毒素的生成機(jī)制及化學(xué)結(jié)構(gòu)解析提供參考。2材料和方法2.1培養(yǎng)nmhah497的f/2條件微小卡羅藻為寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微藻種質(zhì)庫提供的NMBjah047品系。采用f/2培養(yǎng)液配方進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度22℃,光照40μmol/(m2·s),光暗循環(huán)為L∶D=12h∶12h。溶血試驗(yàn)所用血細(xì)胞取自市購鯽魚。2.2藻細(xì)胞溶血活性測(cè)定取對(duì)數(shù)生長期的微小卡羅藻重新接種于新鮮培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件如上所述,接種密度約為3.5×104個(gè)/ml,每天定時(shí)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),繪制藻細(xì)胞的生長曲線,并依據(jù)生長曲線分別取延滯期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期的藻液進(jìn)行取樣,經(jīng)5000r/min(4℃)離心得藻細(xì)胞與去藻上清液,做溶血活性測(cè)定(步驟2.3)。2.3魚類融資劑pbs的體外培養(yǎng)和酶活性檢測(cè)往以上各組藻細(xì)胞中加入100μl的PBS緩沖液,超聲破碎25min,鏡檢無完整細(xì)胞后,經(jīng)13000r/min(4℃)離心得藻細(xì)胞PBS萃取液。各取100μL的藻細(xì)胞PBS萃取液和去藻上清液,置于無菌的200μlPCR管中,加入等體積的4%鯽魚血細(xì)胞懸浮液,于40μmol/(m2·s)光照,29℃下培育5h。實(shí)驗(yàn)中以4%鯽魚血細(xì)胞懸浮液作為零溶血對(duì)照組,加1%TritonX-100的鯽魚血細(xì)胞懸浮液作為100%溶血對(duì)照組。培育后PCR管內(nèi)各組于1000r/min(4℃)離心10min,各取100μl上清液于平底的96孔板上,在酶標(biāo)儀550nm處測(cè)吸光度。溶血度計(jì)算方法參考文獻(xiàn)。2.4溶血毒素的提取和分離2.4.1去藻上清液的溶血活性經(jīng)實(shí)驗(yàn)2.2可知,穩(wěn)定期微小卡羅藻的藻細(xì)胞和去藻上清液都有較高的溶血活性。故用乙酸乙酯將穩(wěn)定期的藻液以1∶2的體積比萃取3次,合并3次萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮,低溫保存?zhèn)溆谩?1)氯甲烷和乙氧溶液采用硅膠柱層析(硅膠100-200目)對(duì)乙酸乙酯濃縮液進(jìn)行分離。用分步洗脫法,洗脫劑配比為二氯甲烷;二氯甲烷和乙醚溶液(V∶V=35∶1);二氯甲烷和乙醚溶液(V∶V=9∶1);二氯甲烷和甲醇溶液(V∶V=9∶1);二氯甲烷和甲醇溶液(V∶V=1∶5);甲醇,各以6倍柱體積洗脫。各洗脫組份經(jīng)減壓濃縮后,取適量經(jīng)過N2吹干,用PBS緩沖液定容到100μl,進(jìn)行溶血試驗(yàn)(注:以下各溶血試驗(yàn)法與此相同)。(2)紫外吸收法rck溶血活性較強(qiáng)的幾組組份作為進(jìn)一步細(xì)分的起始樣品。使用薄層硅膠板(TLCSilicagel60F254,Merck),用毛細(xì)點(diǎn)樣管條狀點(diǎn)樣,以各洗脫劑為展開劑,展層后置于WFH-203三用紫外分析儀中觀察紫外吸收條帶,并噴淋5%磷鉬酸-乙醇溶液(磷鉬酸/乙醇:m/v=5/100),自然晾干后,用電吹風(fēng)加熱至顯色。計(jì)算每條譜帶的Rf值,刮取每條譜帶,合并相同Rf值的譜帶,用各自洗脫劑浸泡3次、過濾、合并、減壓濃縮,冷凍保存?zhèn)溆?并進(jìn)行溶血活性測(cè)定。(3)柱層析分離、濃縮對(duì)薄層層析分離效果不佳的溶血組份用SephadexLH-20柱層析進(jìn)行分離,以分析純甲醇為洗脫劑,分管收集,濃縮各收集組份,冷凍保存?zhèn)溆?并進(jìn)行溶血試驗(yàn)。2.4.2洗脫溶劑配比取穩(wěn)定期的藻液離心(5000r/min),收集濃縮液,冷凍干燥。采用改進(jìn)后的Bligh-Dyer法[12提取總脂。濃縮的總脂上SPE小柱(SiliaBondSiSPE小柱),用分步洗脫法,洗脫劑配比為氯仿;氯仿和丙酮(V∶V=11∶9);氯仿和丙酮(V∶V=7∶13);氯仿和甲醇(V∶V=7∶1);氯仿和甲醇(V∶V=7∶3);氯仿和甲醇(V∶V=1:1);甲醇,4倍柱體積洗脫。各洗脫液經(jīng)減壓濃縮冷凍保存?zhèn)溆?并進(jìn)行溶血活性測(cè)定。2.5對(duì)微藻脂肪酸的提取和測(cè)定取微小卡羅藻干品,采用改進(jìn)后的Bligh-Dyer法提取總脂,參考文獻(xiàn)將總脂皂化后進(jìn)行脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜分析。3結(jié)果3.1藻細(xì)胞溶酶活性的變化為了排除不同生長階段藻液密度對(duì)溶血活性的影響,我們?cè)O(shè)定每次取樣時(shí)藻細(xì)胞總數(shù)相同,即取樣的時(shí)候以第一次取樣的細(xì)胞數(shù)量為基準(zhǔn),以后每次取樣的數(shù)量都與之相同。例如,圖1中第1次取樣時(shí),藻細(xì)胞密度為3.5×104個(gè)/ml,取樣300ml,以這次取樣的細(xì)胞數(shù)量為準(zhǔn),在第18天時(shí)細(xì)胞密度為3.5×105個(gè)/ml恰好為第一次的10倍,則取樣30ml,即可保證細(xì)胞總量的基本不變。圖1中,培養(yǎng)24d的藻大致經(jīng)歷了延滯期(1～3d)、指數(shù)期(4～17d)、平穩(wěn)期(18～20d)和衰亡期(21～24d)4個(gè)生長階段。對(duì)應(yīng)于不同生長階段該藻的溶血活性,通過分析藻細(xì)胞提取液溶血度的趨勢(shì)線可知,藻細(xì)胞提取液的溶血活性在4個(gè)生長階段中基本維持在90%左右的高水平。不同的是,去藻上清液的溶血活性在延滯期及對(duì)數(shù)生長期都維持在較低水平(7%),當(dāng)該藻進(jìn)入平穩(wěn)期時(shí),快速上升并達(dá)到相對(duì)高點(diǎn)(80%),此后維持在90%左右。結(jié)果表明,微小卡羅藻的溶血物質(zhì)是其自身正常生理代謝產(chǎn)物,且自細(xì)胞老化過程中可以釋放至水體環(huán)境中。以此結(jié)果為依據(jù),在保證盡可能多的藻細(xì)胞數(shù)及高溶血活性前提下,下面的實(shí)驗(yàn)均選擇平穩(wěn)期的藻液進(jìn)行溶血毒素的提取。3.2從溶血中提取毒素和分離3.2.1兩種溶血物質(zhì)的初步篩選圖2為微小卡羅藻乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析后各洗脫組份的溶血活性,由圖可見被二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇(9∶1)洗脫的組份F1(67%)和F4(66%)具有最強(qiáng)溶血活性,兩種洗脫劑極性相差較大,因此可初步確定至少存在兩種溶血物質(zhì),分別記為F1和F4。由二氯甲烷/乙醚(35∶1)洗脫的組份F2(57%)次之。以下對(duì)F1和F4兩組份做進(jìn)一步細(xì)分。(1)溶血活性的測(cè)定以二氯甲烷為展開劑,用薄層硅膠板對(duì)樣品F1進(jìn)行展層,紫外分析儀和5%磷鉬酸-乙醇溶液用于條帶指示作用。計(jì)算每條譜帶的Rf值,刮取每條譜帶,合并相同Rf值的譜帶,用二氯甲烷浸泡三次、過濾、合并、減壓濃縮,進(jìn)行溶血活性測(cè)定。結(jié)果如圖3,圖中F1-1與F1-6能被磷鉬酸-乙醇溶液顯色,呈深藍(lán)綠色。F1-2,F1-3,F1-4,F1-5和F1-6在紫外波長365nm下有亮斑。據(jù)圖3顯示,極性稍大的條帶F1-1(Rf=0.077)有最大的溶血活性,因此F1中主要的溶血物質(zhì)為F1-1。(2)萃取管的分離由于樣品F4用薄層層析分析效果不佳,故采用SephadexLH-20柱層析分析。以甲醇為洗脫劑,2ml每管進(jìn)行分管收集,共收集40管。取奇數(shù)號(hào)管的樣品做溶血試驗(yàn),結(jié)果如圖4。在一系列的收集管中存在兩個(gè)明顯的溶血峰,第一個(gè)在17管前后達(dá)到最大(85%),第二個(gè)在27管前后達(dá)到最大(58%),可以推斷樣品F4中至少存在兩種不同的溶血物質(zhì),現(xiàn)分別記為F4-17和F4-27。3.2.2yer法提取的物質(zhì)由Bligh-Dyer法提取的總脂上SPE小柱進(jìn)行梯度洗脫后,各個(gè)分離組份的溶血活性檢測(cè)結(jié)果如圖5。與圖2進(jìn)行對(duì)比,經(jīng)Bligh-Dyer法提取的物質(zhì)中同樣含有兩種溶血活性超過60%的溶血毒素,分別為組份L2(67%)和組份L5(78%)。說明用兩種方法都可以把溶血毒素提取出來,而且對(duì)F1和L2以二氯甲烷為展開劑,進(jìn)行薄層層析并用磷鉬酸進(jìn)行顯色,發(fā)現(xiàn)兩組份的物質(zhì)存在著一致性(圖6),于Rf=0.068處都有一條明顯的顯色斑,對(duì)照?qǐng)D3此斑點(diǎn)的物質(zhì)具有明顯的溶血活性。F4由于用薄層層析分析效果不佳,故與L5的比較有待進(jìn)一步研究。3.3sse含量從表1我們可以看到,微小卡羅藻脂肪酸中含量最多的為16∶0,其次為14∶0。在不飽和脂肪酸中,兩種多不飽和脂肪酸22∶6n3和18∶5n3占據(jù)最大量。4溶血毒素的分離藻類毒素的生物生成機(jī)制非常復(fù)雜,大多數(shù)雙鞭藻類在進(jìn)入平穩(wěn)期末或衰亡期時(shí),其細(xì)胞內(nèi)毒素的生產(chǎn)能力增強(qiáng)。有文獻(xiàn)指出,隨著藻類培養(yǎng)時(shí)間的延長,培養(yǎng)液中的營養(yǎng)不斷被消耗,至平穩(wěn)期或衰亡期時(shí),為保證自身生存繁殖所需要的營養(yǎng)而激發(fā)細(xì)胞內(nèi)合成一些能抑制其他競爭生物生長繁殖的次生代謝產(chǎn)物,因此許多藻類毒素的合成很可能是該藻一種自我保護(hù)機(jī)制。本文對(duì)不同生長期微小卡羅藻溶血活性進(jìn)行了研究,顯示該藻的藻細(xì)胞在整個(gè)生長期間內(nèi)保持著較大溶血活性,說明微小卡羅藻的溶血毒素是該藻自身的正常生理代謝產(chǎn)物,并非受到環(huán)境脅迫后才生成的次生代謝產(chǎn)物。根據(jù)先前的實(shí)驗(yàn)研究,微小卡羅藻的細(xì)胞懸浮液(藻細(xì)胞經(jīng)新鮮海水三次洗滌后,重新懸浮)不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象,表明該藻的溶血毒素主要存在于細(xì)胞內(nèi)部,微小卡羅藻在其細(xì)胞破裂時(shí)才產(chǎn)生毒害作用。另外,去藻上清液在平穩(wěn)期和衰亡期具有明顯的溶血活性,延滯期及對(duì)數(shù)生長期的溶血活性卻很低,說明該藻在生長進(jìn)入平穩(wěn)期及衰亡期后,可能由于細(xì)胞老化破碎或是環(huán)境刺激而釋放至水體環(huán)境中。聯(lián)系到該藻藻液溶血活性具有時(shí)無時(shí)有的報(bào)道,可能是由于微小卡羅藻完整的藻細(xì)胞沒有溶血活性,并且在細(xì)胞破碎或受到刺激時(shí)會(huì)向外界釋放溶血物質(zhì)這兩個(gè)原因所造成的。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,從海洋浮游植物中分離得到的溶血毒素大多數(shù)是不飽和脂肪酸和糖脂類化合物。如從米氏凱倫藻中分離出來的十八碳五烯酸具有溶血活性,Yasumoto等從Amphidiniumcarteri中分離到的溶血毒素為雙半乳糖甘油二酯(DGDG)和單半乳糖甘油二酯(MGDG),Parrish等從兩種有毒的海洋甲藻中分離到的一些甘油糖脂,包括DGDG和MGDG,也都具有溶血活性,但該文同時(shí)又指出這兩種甘油糖脂中的脂肪鏈主要是18∶5n3,因此溶血現(xiàn)象主要是由多不飽和脂肪酸(18∶5n3)還是甘油糖脂的極性頭,或是兩者共同的作用結(jié)果還是個(gè)未知數(shù)。通過對(duì)微小卡羅藻脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),該藻中也有較高含量的多不飽和脂肪酸18∶5n3和22∶6n3,故微小卡羅藻的溶血作用很可能與這兩種多不飽和脂肪酸有關(guān)。溶血毒素的分離分析