流式細胞儀常用技術(shù)方法細胞周期/DNA分析（事法）一、 鞘液準(zhǔn)備（至少3LPBS,提前一天準(zhǔn)備）0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH調(diào)節(jié)，各地蒸餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至1L，0.22um濾膜過濾后，室溫保存。二、 制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍：沒有染色的細胞（制備過程如下，僅不加抗體）三、 實驗步驟取對數(shù)期生長細胞，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化細胞，用培養(yǎng)液吹打，1000rpm，離心10min棄上清；PBS洗2次，加0.5ml吹勻，務(wù)必吹散；加入70%預(yù)冷乙醇中（標(biāo)準(zhǔn)做法是將細胞懸液加入預(yù)冷70%酒精），固定時可加入TritonX-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4°C固定1-2h或過夜（可長至一個月）；4.1000rpmx10min離心收集細胞，PBS洗兩次；5.用0?4mlPBS重懸細胞并轉(zhuǎn)移至離心管中輕輕吹打；

6?加入Rnase-A約3ul至終濃度50ug/ml,37°C水浴消化30min；加入PI約50ul至終濃度約為5-50ug/ml,室溫避光染色30min；用300目濾網(wǎng)過濾，上機檢測。細胞周期/DNA分析（BD公司CycleTESTPLUSDNAReagentKit）一、 鞘液準(zhǔn)備（至少3LPBS,提前一天準(zhǔn)備）0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié)pH到7?2-7?4（用HCl或NaOH調(diào)節(jié)，各地蒸餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后，室溫保存。二、 制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍：沒有染色的細胞（制備過程如下1-6）三、 若做DNA倍體分析，需另設(shè)附加對照管腫瘤細胞和外周血單核細胞的混合管，比例至少為2：1四、 實驗步驟

1. 將細胞消化后，用冷PBS洗細胞兩次，300gx5min（若細胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到500g）,為減少細胞損失可用1.5ml離心管離心；棄上清留大約50ul下面的液體防止碰到細胞團，加入1mlBufferSolution并低速混勻細胞。室溫離心，300gx5min；重復(fù)2、3—次；棄上清留大約50ul下面的液體，加入1mlBufferSolution重懸細胞；計數(shù)細胞，用BufferSolution將細胞密度調(diào)為1x106個/ml；染色：取0?5ml含細胞5x105個；每管加入250ulSolutionA用手輕拍混勻（勿用漩渦混勻）；室溫反應(yīng)10min，保留SolutionA；加入200ulSolutionB，輕輕混勻；室溫反應(yīng)10min，保留SolutionA+B；

F.加入200ul冷SolutionC,輕輕混勻，黑暗處2-8°C孵育F.10min；用50um尼龍網(wǎng)過濾細胞，加入上樣管上流式分析（3h內(nèi)分析完）。淋巴細胞亞群分析一、 鞘液準(zhǔn)備（至少3LPBS,提前一天準(zhǔn)備）0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié)pH到7?2-7?4（用HCl或NaOH調(diào)節(jié)，各地蒸餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后，室溫保存。二、 制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍：沒有染色的細胞（制備過程如下，僅不加抗體）三、 實驗步驟1?采集血液樣品，取100ul抗凝全血加入每支試管中，注意不要碰到管壁。輕輕混勻，依次加入20ulIsotypeControl（如沒有的話用沒染色細胞代替），另外幾管加入20pl熒光抗體。室溫避光保存20分鐘。加入1*紅細胞溶解液450叫渦旋混勻避光保存10min，待管內(nèi)液體透亮，300-500g離心5min，去上清

4?加PBS2mlPBS渦旋混勻，300-500g離心5min,棄上清，然后加0.5mlPBS搖勻。過300目尼龍網(wǎng)，4笆避光1h內(nèi)上機檢測；若不能及時上機，加入0?5ml含1%多聚甲醛的PBS，放4°C冰箱保存，48h內(nèi)上機檢測。AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡（BD公司Annexin-FITC/PI試劑盒）細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。AnnexinV是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用AnnexinV結(jié)合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。一、鞘液準(zhǔn)備（至少3LPBS，提前一天準(zhǔn)備）

0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH調(diào)節(jié)，各地蒸餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至1L，0.22um濾膜過濾后，室溫保存。二、 制備三個質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細胞儀的熒光補償和設(shè)置十字門的范圍（可選）：a） 沒有染色的細胞；b） 僅用熒光標(biāo)記的annexinV染色的細胞；（細胞先誘導(dǎo)凋亡：42°C水浴10min）c） 僅用PI染色的細胞.（一半活細胞一半乙醇固定的細胞）三、 實驗步驟細胞收集：懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中，1000r/min離心8min，收集到1.5ml離心管，用冷PBS洗細胞兩次，，1000r/min離心8min，然后用1*bindbuffer重懸細胞，配成樣本細胞數(shù)為（1~5）*106個/mL。用100ul細胞懸液（1*105個cell）到離心管中。3?加入5ulAnnexinV-FITC和5ulPI，混勻細胞，室溫下避光孵育15min。4.加入400ul1*bindbuffer每管，用流式細胞儀分析，一小時內(nèi)完成。結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細

胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+），也有認為是晚期凋亡細胞（認為左上象限為壞死細胞FITC-/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。Caspase-3-FITC檢測細胞凋亡(BD公司FITC-CONJUGATEDMONOCLONALACTIVECASPASE-3ANTIBODYAPOPTOSISKITI)一、 鞘液準(zhǔn)備（至少3LPBS，提前一天準(zhǔn)備）0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH調(diào)節(jié)，各地蒸餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至1L，0.22um濾膜過濾后，室溫保存。二、 制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍：沒有染色的細胞（制備過程如下，僅不加抗體）三、 實驗步驟

將細胞消化后，用冷PBS洗細胞兩次，1000rpmx8min（若細胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到1500rpm），用cytofix/cytopermtmsolution重懸細胞，將細胞密度調(diào)整為1x106個/0.5ml；冰上孵育細胞20min；吹吸細胞，離心，棄上清，室溫用Perm/washTMbuffer沖洗兩次；計數(shù)總