懷山藥種質資源玻璃化法超低溫保存技術體系的建立

甘薯又稱帶刺，是甘薯科的一種多年生包裹性藤本植物。主要產于河南省河南省徐州市的文縣、武干、濟陽等地（古懷慶地區(qū)管轄），具有良好的藥物和食物優(yōu)勢。入藥,具有健脾、補脾、固腎、益精、助五臟、強筋骨、益氣力之功效;食用營養(yǎng)價值高,為滋補佳品,故素有“懷參”之稱,其產品不僅暢銷國內各地,還遠銷港澳地區(qū)和東南亞以及歐、美等地。目前對懷山藥主要開展了栽培管理、組織培養(yǎng)、藥用成分、加工工藝、藥理作用以及病毒病和脫毒快繁等一系列研究工作,而關于種質資源則主要采用田間保存法,不僅需要大量的人力、物力和財力,而且還不可避免地受到病蟲害和各種自然災害的影響。因此,進行懷山藥種質資源的離體保存研究就具有十分重要的意義。玻璃化法超低溫保存是植物細胞和組織長期穩(wěn)定保存的較好方法,可以節(jié)省空間,避免繼代、病蟲害和氣候等因素造成的種質丟失,并且設備簡單、操作簡便,已經成功地應用于甘蔗、蘋果、柿、胡蘿卜、甘薯、紫羅蘭等植物種質資源的保存。有關薯蕷的超低溫保存在國外已有研究,但在國內尚未見報道。本試驗成功地建立了懷山藥種質資源玻璃化法超低溫保存的技術體系,為懷山藥種質資源的長期保存提供了一條有效途徑。1材料和方法1.1代培養(yǎng)的藥種試驗材料為河南師范大學“四大懷藥”組織培養(yǎng)室繼代培養(yǎng)的懷山藥無菌苗,共有5個品種,分別為鐵棍山藥(道地的懷山藥)、47號山藥(鐵棍山藥和滑縣山藥的雜交種)、B號山藥、太谷山藥和懷慶1號。1.2超低溫保存技術以懷山藥帶芽莖段為材料進行玻璃化法超低溫保存,并采用培養(yǎng)法檢測保存后材料的成活率,從而篩選出最佳的玻璃化法超低溫保存技術體系。該方法包括以下程序。1.2.1低溫疲勞繼代生長60d的懷山藥的試管苗置于4℃冰箱中低溫鍛煉7d。1.2.2培訓在無菌條件下切取1~1.5cm的帶芽莖段,轉至含5%蔗糖+3%甘露糖的培養(yǎng)基內,置4℃冰箱預培養(yǎng)2d。1.2.3不同保護劑的組成玻璃化保護劑(protectantofvitrifiablesolution,簡稱PVS)由不同配比的甘油、乙二醇、聚乙二醇、二甲基亞砜、蔗糖、甘露糖組成。本實驗采用的5種玻璃化保護劑是參考劉云國對蘋果莖尖進行玻璃化超低溫保存的方法設置的,其組成成分見表1。預培養(yǎng)后的莖段先用60%的PVS在室溫下處理60min,再用100%的PVS在0℃條件下處理60min。1.2.4材料的冷凍儲存將玻璃化保護劑處理過的材料迅速放入液氮中,保存24h。1.2.5u3000發(fā)酵將材料從液氮中取出,采用4種方式化凍,分別為4℃冰箱、25℃常溫、37℃水浴和45℃水浴,化凍后用含5%蔗糖的MS培養(yǎng)液洗滌4次,每次停留10min。1.2.6密度對生苗生長的影響將玻璃化超低溫保存化凍洗滌后的懷山藥莖段接種到再生培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),記錄成活率及恢復生長的時間,并在60d時比較超低溫保存后的再生苗與常溫保存試管苗的形態(tài)差異。成活率=(玻璃化超低溫保存后成活的莖段數)/(保存的總莖段數)×100%。本試驗均為單因子試驗,每次處理25個帶芽莖段,實驗重復4次。試驗結果應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行Dunnett法和LSD法數據分析。實驗中所使用的培養(yǎng)基均為MS+KT2mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖+0.5%瓊脂,培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,光照14h·d-1。2結果與分析2.1不同快速化凍條件下pvs1的成活率經不同玻璃化保護劑處理后的材料,投入液氮保存1d后,于37℃水浴中快速化凍,然后轉至再生培養(yǎng)基上,30d時統(tǒng)計其成活率,結果見表2。由表2可以看出,在37℃水浴快速化凍的條件下,PVS1的成活率最高,達77.14%;其次是PVS3,成活率為67.02%;PVS2、PVS5的成活率差異不大,分別為42.09%和41.30%,沒有達到顯著水平;成活率最低的是PVS4,只有33.61%。而對照(CK)中因為沒有玻璃化保護劑,導致細胞內結冰,細胞嚴重受損,成活率為0。通過Dunnett法和LSD法檢驗,各玻璃化保護劑與對照之間以及5種玻璃化保護劑之間進行比較,其成活率都達到極顯著差異?？梢?PVS1是進行懷山藥種質資源玻璃化超低溫保存的最佳玻璃化保護劑。2.2化凍溫度對化凍效果的影響懷山藥帶芽莖段以PVS1為玻璃化保護劑,在液氮中保存1d后,采用不同的溫度進行化凍,然后轉入再生培養(yǎng)基上,30d時統(tǒng)計其成活率,結果見表3。由表3可以看出,不同的化凍方式對玻璃化超低溫保存的效果也有影響,在以PVS1為玻璃化保護劑的條件下,隨著化凍溫度的升高,成活率也增大,當化凍溫度為37℃時,山藥帶芽莖段的成活率達到最大值,當化凍溫度繼續(xù)升高至45℃時,莖段的成活率又開始下降。25℃常溫化凍、37℃水浴快速化凍和45℃水浴快速化凍分別與4℃冰箱化凍的成活率進行Dunnett法檢驗,差異均達到極顯著水平,進行LSD法檢驗,其成活率也都達到極顯著差異?？梢?37℃水浴快速化凍為懷山藥種質資源玻璃化超低溫保存的最佳化凍方式,化凍溫度太高或太低都不利于莖段的成活。2.3再生苗的形態(tài)測定將經過玻璃化超低溫保存后的懷山藥帶芽莖段與常溫保存的懷山藥帶芽莖段同時接種到培養(yǎng)基上,前者10d開始恢復生長,15d莖段開始長出新芽,20d長出新葉,而后者7d即可恢復生長,13d長出新芽,18d長出新葉。60d時測定再生苗的形態(tài)指標,結果見表4。從表4可以看出,超低溫再生苗與常溫苗的形態(tài)指標基本一樣,經Dunnett法檢驗,其株高、葉片數、芽數和莖節(jié)長雖有差異,但未達顯著水平。說明用玻璃化超低溫保存技術保存懷山藥種質資源是合適的,能夠保證遺傳資源的穩(wěn)定性。2.4不同菌株對滲透液中成活率的影響按照上述最佳的玻璃化超低溫保存法(即采用PVS1和37℃快速水浴化凍)對懷山藥5個品種的帶芽莖段進行液氮保存,保存24h后轉入再生培養(yǎng)基上,30d統(tǒng)計其成活率,結果如表5所示。由表5可以看出,懷山藥玻璃化超低溫保存后的相對存活率隨基因型而異,表現(xiàn)出明顯的品種間差異。經Dunnett法和LSD法檢驗,各懷山藥品種之間以及47號山藥(CK)與其他懷山藥品種之間,成活率均表現(xiàn)出極顯著的差異,其中,B號山藥的相對存活率最高,達77.14%;懷慶1號和鐵棍山藥次之,分別為54.02%和67.24%,47號山藥的相對存活率最低,僅為39.12%。3玻璃化保護劑的篩選玻璃化超低溫(-196℃)保存是目前長期而穩(wěn)定地保存植物種質資源的最好方法,在液氮低溫下,所有的細胞分裂和代謝活動停止,因而植物材料在超低溫保存過程中不會產生遺傳性狀的改變。該方法中起關鍵作用的是玻璃化保護劑,其基本原理在于植物材料經由玻璃化保護劑處理后,直接放入液氮時以玻璃態(tài)固化,不產生冰晶,從而避免冰凍造成的機械損傷和溶液效應損傷,目前已用于多種植物組織培養(yǎng)物的種質保存。艾鵬飛等對柿休眠芽莖尖進行了玻璃化超低溫保存及植株再生研究,結果表明用玻璃化保護劑30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4mol/L蔗糖處理材料時,成活率高達70.2%。曾繼吾等也用此玻璃化保護劑對番木瓜含1~2個葉原基的莖尖(1.5~2.5mm長)進行玻璃化超低溫保存24h后,轉入繼代培養(yǎng)基上再培養(yǎng),成活率和再生率分別達53.7%和52.6%。周小梅等對玉米遺傳轉化中常用的受體材料幼胚、胚性愈傷組織和懸浮細胞系進行了玻璃化法超低溫保存,發(fā)現(xiàn)采用同樣保護劑,材料的相對存活率也可達80%。D.Hirai和A.Sakai在優(yōu)化甘薯超低溫保存條件時,指出這一玻璃化保護劑能顯著提高甘薯莖尖的存活率,存活率達60%以上。但劉云國等在研究蘋果種質資源玻璃化法超低溫保存技術時發(fā)現(xiàn),以30%甘油+15%乙二醇+30%DMSO或40%甘油+10%乙二醇+5%DMSO+45%蔗糖作玻璃化保護劑的效果較好,成活率可達79%。Leunufna等對薯蕷(Dioscorea)4個品種(D.bulbiferaL.,D.oppositifoliaL.,D.alataL.和D.cayenensisLam.)的莖尖(2~4mm)進行玻璃化超低溫保存時,發(fā)現(xiàn)13.7%蔗糖+30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO作保護劑的效果較好,成活率和再生率高達86%和100%。非洲紫羅蘭莖尖進行玻璃化超低溫保存時,采用10%DMSO+0.5mol/L蔗糖或5%DMSO+0.75mol/L蔗糖作玻璃化保護劑也能達到80%~100%的存活率和80%的再生率。本試驗發(fā)現(xiàn)懷山藥的最佳玻璃化保護劑為PVS1(22%甘油+13%乙二醇+13%聚乙二醇+10%DMSO),在它的作用下,超低溫保存后莖段轉入培養(yǎng)基上再培養(yǎng)時,成活率可達77.14%?？梢?植物種類不同或者超低溫保存的組織培養(yǎng)物不同,所需要的玻璃化保護劑也不同。在進行玻璃化超低溫保存時,不僅要篩選出合適的玻璃化保護劑,而且還必須篩選出符合試驗材料特性的化凍方式。對于不同的材料,化凍方式也不同,一般以35~40℃水浴快速化凍的效果較好。陳勇等在胡蘿卜細胞和原生質體的玻璃化法超低溫保存的研究中發(fā)現(xiàn),0℃低溫化凍,其存活率僅為59.4%,25℃常溫化凍存活率為69.7%,而37℃水浴快速化凍可明顯提高材料的存活率,高達83.3%。陳勇等還對甌柑愈傷組織的玻璃化法超低溫保存進行了研究,比較了4~6℃低溫、室溫、自來水沖洗及30℃、40℃、50℃水浴不同化凍方式對甌柑愈傷組織玻璃化凍存后存活率的影響,發(fā)現(xiàn)不同化凍方式對甌柑愈傷組織存活率的影響較大,在4~6℃冰箱內慢速化凍、室溫和30℃水浴化凍的TTC值較低,細胞生活力較弱,自來水流水(18.5±2)℃沖洗化凍和40℃水浴化凍的存活率較高,化凍后的愈傷組織保持了較高的生活力,TTC值相近,分別為71.84%和85.62%。本試驗對懷山藥莖段進行玻璃化超低溫保存,結果也表明37℃水浴快速化凍可以明顯提高莖段的成活率,是懷山藥的最佳化凍方式。但有些木本植物的冬芽超低溫保存后必須在0℃低溫下化凍才能達到最好的效果?？梢?保存材料不同,其化凍溫度也不相同。在進行玻璃化超低溫保存時,如果基因型不同,則保存效果也會存在明顯的差異。王子成等對柑橘的4個品種進行了玻璃化超低溫保存,發(fā)現(xiàn)枳殼和橙柑的存活率最高達100%,臍橙次之,為93.33%,紅肉存活率最小,為91.67%。S.Leunufna等對薯蕷4個品種的莖尖進行玻璃化超低溫保存時,也發(fā)現(xiàn)各品種間的存活率存在差異,其中D.oppositifoliaL.存活率最高