實驗四SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)

(1)學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。

(2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)。實驗四SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(1)實驗原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N—甲叉雙丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)。Acr和Bis單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，但在具有自由基團體系時就能聚合。引發(fā)自由基團的方法有化學法和光化學法兩種?；瘜W法的引發(fā)劑是過硫酸胺（Ap），催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）；光化學法是以光敏感物核黃素來代替過硫酸胺，在紫外光照射下引發(fā)自由基團。采用不同濃度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，產(chǎn)生不同孔徑的凝膠。因此可按分離物質(zhì)的大小，形狀來選擇凝膠濃度。實驗原理在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的遷移率取決于它所帶的凈電荷的多少、分子的大小和形狀。如果用還原劑（如巰基乙醇或二硫蘇糖醇等）和十二烷基硫酸鈉（縮寫SDS）加熱處理蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵將被還原，并且1g蛋白質(zhì)可定量結(jié)合1.4gSDS，亞基的構(gòu)象呈長橢圓棒狀。由于與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS呈解離狀態(tài)，使蛋白質(zhì)亞基帶上大量負電荷，其數(shù)值大大超過蛋白質(zhì)原有的電荷密度，掩蓋了不同亞基間原有的電荷差異。各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物具有相同的電荷密度，電泳時純粹靠凝膠的分子篩效應(yīng)進行分離。在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的遷移率取決材料與試劑1．材料：標準樣和BSA（小牛血清白蛋白）,已經(jīng)與上樣緩沖液混合完畢2．試劑1）30%丙烯酰胺(Acr)/0.8%N,N'-甲叉雙丙烯酰胺（BIS）2）5×SDS/電泳緩沖液,稀釋成1×3）Tris-HCl/SDS,pH6.84）Tris-HCl/SDS,pH8.85）10%過硫酸銨(AP)6）TEMED商品試劑材料與試劑1．材料：實驗步驟1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。2．制分離膠：按所需的濃度配制12.5％分離膠。30%Acr-Bis

Tris-HClpH8.8

H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120

l20

l

灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面），等膠自然凝聚后（這時候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）實驗步驟1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。30%Acr-3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis

Tris-HClpH6.8

H2O10%APTEMED400

l750

l1800

l50

l7.5

l3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入電泳槽內(nèi),加入電泳緩沖液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加樣孔之間的間隔發(fā)生扭曲，可以用注射器針頭小心地加以整理。

4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣7.5

L。6．電泳：先恒壓80V，待樣品進入分離膠后，調(diào)電壓為120V（恒壓）。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，停止電泳。5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準備染色。8．凝膠染色：使用考馬斯亮藍R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準備染色。注意事項(1)Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應(yīng)戴手套和口罩。

(2)玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。

(3)樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。

(4)灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。

(5)切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū)帶扭曲。（6）電泳時應(yīng)選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會影響電泳效果。

(7)稀釋5×SDS/電泳緩沖液至1×濃度灌入電泳槽，需800毫升。注意事項1.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開呈直角狀，放入厚薄兩片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭頭向上，旁邊兩條小玻璃條與薄玻璃接觸，使之形成一個間隙。2.在平整的桌面上放下玻璃與夾子，使玻璃和夾子的底面完全對齊，向外扳動塑料卡口，關(guān)緊夾子。1.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開呈直角狀，放入厚薄兩片玻3.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭頭向上。按彈簧夾，將玻璃夾卡入制膠架。在玻璃的間隙內(nèi)灌膠，放上梳子，待膠凝固。4.取出制好的玻璃（連帶膠），將玻璃放入電極架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向電極架，厚玻璃的箭頭朝上，玻璃與紅色橡膠條必須完全緊貼。（需同時放置兩塊制好的膠，如只使用一塊則另一面須用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條完全緊貼。）正常安裝則會形成一個密閉的容器。3.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上5.將底座的開關(guān)打開，并向外撥動透明的架子，使中間空隙增大，放入電極架。6.如圖所示將電極架往下