端粒酶在腫瘤臨床檢測與治療中的意義［摘要］近年來，國內(nèi)外對(duì)端粒酶作為腫瘤治療靶分子的可能性，尤其對(duì)測定端粒酶診斷腫瘤的潛在價(jià)值，都非常關(guān)心。為了滿足讀者的需要，特在本期發(fā)表了這篇有關(guān)端粒酶的綜述，讀者可結(jié)合本期簡報(bào)欄中一組國內(nèi)研究端粒酶的報(bào)道，綜觀國內(nèi)外的研究現(xiàn)況。必須指出，雖然端粒酶在腫瘤組織中檢出率很高，但由于存在非特異性，要應(yīng)用于腫瘤的臨床診斷還有一段距離，仍需從定性和定量方面進(jìn)行廣泛扎實(shí)的觀測研究，弄清假陽性的成因，排除各種取標(biāo)本方式對(duì)檢測結(jié)果的影響，進(jìn)一步明確與臨床的相關(guān)性。端粒是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，在正常人體細(xì)胞中，可隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短。端粒的復(fù)制不能由經(jīng)典的0\六聚合酶催化進(jìn)行，而是由一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶一一端粒酶完成。近年來研究表明，端粒酶活性的表達(dá)與細(xì)胞衰老和某些疾病，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都具相關(guān)性。能否將酶活性作為腫瘤診斷的指標(biāo)，以及將端粒酶作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，是當(dāng)前較受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。一、端粒及端粒酶早在30年代，「1161和…1|的0"等就已發(fā)現(xiàn)了端粒結(jié)構(gòu)的存在。1978年，四膜蟲的端粒結(jié)構(gòu)首先被測定，它是由6個(gè)核苷酸重復(fù)排列的(1204)1!所組成，且在每條染色體重復(fù)次數(shù)不等。人的端粒約由15個(gè)吐反復(fù)串聯(lián)的17八660結(jié)構(gòu)組成，隨著細(xì)胞分裂，每代大約丟失50200bp。端粒的雙鏈DNA序列位于染色體"端，并在3'端突出約12~16個(gè)0核苷酸，在整個(gè)真核生物中都是高度保守的。這些突出的G可通過Hoogsteen型氫鍵連接形成G_G二聚體，亦可通過C-G典型的Watson-Crick連接及G_G氫鍵形成C_G*G三聯(lián)體及更為常見的G4-DNA四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。端粒形成的特殊結(jié)構(gòu)為染色體提供了保護(hù)性帽子，使DNA免遭核酸酶及連接酶的破壞，預(yù)防0-八損傷后斷端染色體的粘連，在染色體定位和復(fù)制中起到重要作用。端粒酶是一種能夠催化延長端粒末端的核糖核蛋白（RNP），由咖々和相關(guān)蛋白組成。它能夠以自身攜帶的咖八為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA并添加于染色體末端，從而維持了端粒長度的穩(wěn)定。四膜蟲的 RNA組分長為159個(gè)核苷酸，其中從第43到51位點(diǎn)為5'-CMCCCCAA-3'的模板，編碼1.5個(gè)拷貝的端粒序列。人的端粒酶由Morin于1989年在人癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其序列在 1995年被克隆［1］，其中的沿"組分由450個(gè)核苷酸組成，模板RNA為y-CUAACCCUAAC-3'。目前，？3土化5011等［2］已從皮膚鱗狀上皮癌細(xì)胞中提取出了酶RNA,并將其編碼基因定位于3q26.3。對(duì)端粒酶蛋白的研究，近年來報(bào)道較多。四膜蟲的蛋白組成是最早被測定出來的，包括分子量為 80000和95000兩個(gè)亞基，另一種纖毛動(dòng)物￡卯10165則含123000和43000兩個(gè)亞基。交聯(lián)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明P95和P123都結(jié)合于DNA引物，四膜蟲的P80主要與端粒酶RNA相結(jié)合，可能是酶具催化活性的結(jié)構(gòu)域。在酵母中，廠1基因的活化可以保持端粒的長度。3”化-等［3］用編碼酵母端粒酶RNA的基因TLCl產(chǎn)物與Estl特異性的免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)Estl沉淀物中有端粒酶活性，可以延長端粒引物，且只需要三磷酸脫氧鳥苷（461朽和三磷酸脫氧腺苷（dTTP）的存在，提示Estl也有酶催化活性。Nakamura等［4］用纖毛蟲P123序列降解引物作酵母的PCR擴(kuò)增，構(gòu)建出的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因trtl+,可以編碼出一個(gè)116000的蛋白，與？123，￡512?相比較，在7個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域1，2，A，B，C，D,￡中都有極為相似的序列。在￡3?。?乂口作5564sequence1”@）數(shù)據(jù)庫中可以找到一個(gè)與？ 123/￡5{2口/1”11口相同源的人的基因編碼產(chǎn)物…燈，被認(rèn)為可能是人的端粒酶催化亞單位。事實(shí)上，也已有文獻(xiàn)證明哺乳動(dòng)物有與四膜蟲？80同源的1?1存在［5］。對(duì)于活化端粒酶，有很多維持端粒長度因素的假說。Harley*［6］認(rèn)為正常人細(xì)胞端粒縮短到一定程度時(shí)即進(jìn)入第一死亡期Ml,一些細(xì)胞由于基因突變可能逃逸則期，進(jìn)入第二死亡期M2期。這時(shí)端粒酶仍為陰性，端粒仍進(jìn)一步縮短，大部分細(xì)胞死亡。生存下來的細(xì)胞逃逸M2期，獲得無限增殖能力，端粒酶呈陽性，成為永生化細(xì)胞。在這個(gè)過程中，癌基因和抑癌基因起到了不容忽視的作用。在人的纖維母細(xì)胞中，至少有3個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子0-化3，1￡1和E2F在老化的細(xì)胞中受抑制。其中E2F的受抑制很可能是P21和P16的過度表達(dá)，抑制了細(xì)胞周期蛋白激酶忙0。）的活性，從而導(dǎo)致了口此蛋白磷酸化水平的降低［7］。Shay等［8］使用DNA腫瘤病毒癌基因人乳頭狀瘤病毒（HPV）E6和E7做轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)了從Ml期逃逸需要P53和PRb的共同作用。另一些實(shí)驗(yàn)表明，端粒酶的活性與細(xì)胞周期、有絲分裂具一定相關(guān)性。Zhu等［9］觀察到，當(dāng)細(xì)胞被阻于以”期，端粒酶活性與非同步化細(xì)胞中酶活性相似；重新進(jìn)入細(xì)胞周期后，活性升高；阻于3期時(shí)，酶活性最高；而阻于62/\1期的細(xì)胞幾乎沒有酶活性.進(jìn)入00期的細(xì)胞，其端粒酶的活性幾乎不受影響。人體內(nèi)？化2基因編碼產(chǎn)物可以影響到曲霉菌的犯似（「761-「「0313六）蛋白激酶的活性［10］。？化2直接與端粒0似結(jié)合，在表達(dá)端粒酶活性的細(xì)胞中，僅高度集中于極少量的端粒處。在如匕細(xì)胞周期中，02+21期表達(dá)增高，61期表達(dá)下降，這與2匕觀察到的相反，提示？化2抑制酶活性，同時(shí)兩者都與細(xì)胞周期的調(diào)控相關(guān)。二、臨床意義及檢測方法已知85%的人腫瘤組織中己發(fā)現(xiàn)了端粒酶活性的表達(dá)，而與腫瘤相鄰的正常組織或良性病變僅為4%左右。因此，把端粒酶作為腫瘤基因診斷的指標(biāo)和基因治療的新靶點(diǎn)將是很有可能的。在…等［11］所測的100個(gè)永生化細(xì)胞系中，94個(gè)腫瘤衍生的細(xì)胞株端粒酶陽性，6個(gè)癌病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株，有4個(gè)大T抗原轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株端粒酶表達(dá)陽性，而其他22種正常組織和50種良性腫瘤組織表達(dá)均為陰性。倡'打等［12］在104例未治療的膀胱腫瘤中發(fā)現(xiàn)，88%的腫瘤組織呈端粒酶陽性，其中79%的一期腫瘤，84%的二期腫瘤和87.5%三期腫瘤呈陽性，5例原位癌也均呈陽性。但在膀胱結(jié)石，良性尿道狹窄，良性前列腺增生和炎癥組織中端粒酶呈現(xiàn)陰性，35例正常標(biāo)本也均呈陰性。對(duì)于惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的檢測也發(fā)現(xiàn)，在16例良性瘤組織中端粒酶表達(dá)均為陰性，而在3例惡性瘤組織中端粒酶活性分別達(dá)87.6,71.2，180.3個(gè)單位［13］，這對(duì)過去診斷困難的惡性嗜鉻細(xì)胞瘤提供了一個(gè)新的思路。在諸多其他腫瘤中同樣有很高的端粒酶活性表達(dá)，常見的如肝癌(86%)，小細(xì)胞肺癌(100%)，非小細(xì)胞肺癌(78%)，胰腺癌(95%)，卵巢癌(91%)，膀胱腫瘤(92%)，黑色素瘤(86%)。當(dāng)然，什么情況下出現(xiàn)假陽性，如何鑒別排除，端粒酶檢測的取樣標(biāo)本及其與臨床診斷的相關(guān)性，還有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究。端粒酶活性的高低與腫瘤分化的程度也具相關(guān)性。…！…“等［14］的實(shí)驗(yàn)指出，在25例惡性卵巢腫瘤中92%呈端粒酶陽性，同時(shí)在分化差的惡性腫瘤中酶活性明顯高于其他腫瘤。Nakatani等［15］在對(duì)腦腫瘤細(xì)胞測定中指出，測到酶活性的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性度明顯高于測不到酶活性的星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤，認(rèn)為端粒酶的活性可能是檢測多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度的一個(gè)全新標(biāo)志。除了端粒酶本身，有人證實(shí)酶組分咖40WC11TelomereRNA,虹幻水平與腫瘤的發(fā)生有相關(guān)性。80如1~等［16］用原位雜交的方法測定了300多份腫瘤樣本，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤樣本的⑴”表達(dá)各不相同；26%的非小細(xì)胞肺癌，41%的肺鱗癌表達(dá)可測的「1而肺腺癌和大細(xì)胞癌則很少表達(dá)。在其他如乳腺癌，卵巢腺癌也有低頻⑴”表達(dá)。在43%表達(dá)…的宮頸癌中，鱗癌及腺癌表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。正常的睪丸生殖細(xì)胞可表達(dá)一定的虹！？，惡性睪丸生殖細(xì)胞中有73%表達(dá)，而分化的卵巢生殖細(xì)胞腫瘤和睪丸畸胎瘤則缺乏hTR的表達(dá)。檢測端粒酶的活性，最初采用同位素標(biāo)記核苷酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳間接檢測組織提取物中的酶活性。1994年經(jīng)改進(jìn)的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法0：狀？）［11］，原理是將PCR擴(kuò)增端粒反應(yīng)的3'-末端引物，在端粒酶的催化下延伸，增加11八666重復(fù)序列，再將這種端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行？€口擴(kuò)增，故表達(dá)量提高了104倍。用銀染色法，熒光標(biāo)記，生物素標(biāo)記，酶聯(lián)免疫吸附法連113&就可檢測，不用放射性同位素顯示，同樣有較好的效果。由于對(duì)端粒酶結(jié)構(gòu)研究尚不完善，目前對(duì)于聚合酶活性位點(diǎn)及錨定位點(diǎn)的抑制研究還很少，但對(duì)于酶RNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制抑制劑和模板RNA抑制的研究已趨向深入。使用六打與此匕腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)傳代至第15代，用生物素標(biāo)記人的探針與端粒序列雜交，發(fā)現(xiàn)端粒進(jìn)行性縮短，除去421后，端粒在25代之內(nèi)都沒再增長，也沒有衰老現(xiàn)象發(fā)生［17］。?1的他虹等［18］則使用無細(xì)胞生化端粒酶分析，發(fā)現(xiàn)7-deaza_dGTP和7_deaza_dATP都是可能的端粒酶抑制劑。半數(shù)抑制濃度(1€50)對(duì)746&2&-0…為11pmol/L,對(duì)7-deaza-dATP為8Mmol/L,二者都由端粒酶介導(dǎo)參入DNA。因此可同時(shí)用來研究端粒DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)酶活性的影響。此外，？6叩等［1］還用反義&了8抑制惡性腫瘤，并可因此導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。Hamilton等［19］通過使用肽核苷酸(?\&3)結(jié)合于咖4活性位點(diǎn)，認(rèn)為C50-C52及C56是PNA識(shí)別并被抑制劑結(jié)合的位點(diǎn)。端粒酶作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，目前己逐漸被重視起來。但是，研究過程中也出現(xiàn)了一些有待解決的問題。在一些腫瘤細(xì)胞株中沒有酶活性的表達(dá)，提示可能有非端粒酶介導(dǎo)的端粒長度控制途徑，在臨床監(jiān)測中可能出現(xiàn)假陰性。另外，不同的瘤組織對(duì)不同的檢測手段敏感性不同，只有我們對(duì)不同腫瘤的特性有了更充分的認(rèn)識(shí)，才可找到更為專一、敏感、可靠的檢測方法。無論如何，一旦上述的矛盾問題得以解決，腫瘤的臨床監(jiān)測與治療將會(huì)取得突破性進(jìn)展。不僅如此，目前尚有研究證明端粒酶與其他一些疾病，包括艾滋病都有一定相關(guān)性［20］?？梢灶A(yù)見，隨著研究的深入，端粒酶將為多種疾病的診斷與治療提供快捷，特異，副作用小的檢測新途徑。參考文獻(xiàn)FengJ,FuckWD,WangSS,etal.TheRNAcomponentofhumantelomerase.Science,1995,269：1236-1241.ParkinsonEK,NewboldRF,KeithWN.Thegeneticbasisofhumankeratinayteimmortalisationinsquamouscellcarcinomadevelopment:theroleoftelomerasereactivation.EurJCancer,1997,33:727-734.33SteinerBR,HidakaK,FutcherB.AssociationoftheEstlproteinwithtelomeraseactivityinyeast.ProcNatiAcadSciUSA,93:2817-2821.NakamuraT虬MorinGB,ChapmanKB,etal.Telomerasecatalyticsubunithomologsfromfissionyeastandhuman.Science,1997,277:955-959.HarringtonL,McPhail 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