苦瓜多糖脫蛋白方法的比較研究

杏仁是甘薯科的一種水果。它具有良好的食用價(jià)值和明顯的藥物功能，被稱為“植物”。苦瓜多糖作為苦瓜中含量較高的生物活性物質(zhì)之一,引起了人們的極大興趣和廣泛關(guān)注。研究表明,苦瓜多糖具有降血糖、降血脂、抗腫瘤和提高人體免疫力的功效。天然植物中的多糖與蛋白質(zhì)2種高分子成分往往共存,且常結(jié)合形成糖蛋白復(fù)合物,因此從粗多糖中脫除蛋白質(zhì)較為困難。另外,植物多糖一般采用熱水浸提-乙醇沉法提取,所得粗多糖含較多游離的蛋白質(zhì),這對(duì)苦瓜多糖的分離純化帶來(lái)了很大的影響,不利于進(jìn)一步對(duì)苦瓜多糖的結(jié)構(gòu)及其生物活性的研究。因此,尋找一種盡可能多地除去苦瓜粗多糖中的蛋白質(zhì)且有效保留多糖成分的方法已成為了一個(gè)突出的問(wèn)題。對(duì)此,筆者就幾種脫蛋白方法進(jìn)行了比較研究,探索了苦瓜多糖最佳脫蛋白工藝;并測(cè)定了脫蛋白前后苦瓜多糖的紫外光譜特性,以期為苦瓜多糖的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)g-25、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品苦瓜,購(gòu)于韶關(guān)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);木瓜蛋白酶(sigma公司)、牛血清蛋白(sigma公司)、考馬斯亮藍(lán)G-250、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品;三氯乙酸、鹽酸、濃硫酸、蒽酮、氨水、三氯甲烷、磷酸、正丁醇、無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮等均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.2儀器、儀器和儀器721型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠;FA1104電子天平,上海精天電子儀器廠;DK-8D數(shù)顯電熱恒溫水槽,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本東京理化器械株式會(huì)社;ZK-828型電熱真空干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。1.2測(cè)試方法1.2.1提取液用量的提取苦瓜多糖的提取和制備參照文獻(xiàn)進(jìn)行。稱取已干燥的苦瓜粉末10g,置索氏提取器中,加入石油醚100ml,90℃回流提取1h脫脂,抽濾,濾渣經(jīng)揮干溶劑后,加入200ml80%乙醇于90℃下回流1h,過(guò)濾,離心。上清液濃縮至20ml,加入無(wú)水乙醇使醇沉濃度達(dá)80%,于4℃冰箱中醇沉過(guò)夜,離心,取沉淀,并依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌2次,真空干燥至恒重,即得苦瓜粗多糖,備用。1.2.2脫蛋白質(zhì)法(1)veing試劑苦瓜粗多糖溶液(50ml)以體積比1∶5加入Seveage試劑,混合物劇烈振搖15min離心(4000r/min,5min),除去水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)。反復(fù)進(jìn)行至無(wú)蛋白層,得到脫蛋白液。(2)脫蛋白液的制備苦瓜粗多糖溶液(50ml)用10%三氯乙酸調(diào)節(jié)其pH值至3,室溫下放置過(guò)夜,離心(4000r/min,5min),棄去沉淀,反復(fù)進(jìn)行直至無(wú)沉淀,得到脫蛋白液。(3)西瓜蛋白酶脫蛋白液的制備苦瓜多糖溶液(50ml),調(diào)pH值至6.5,60℃下放置1h后,用1.25%(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒溫5h后,離心(4000r/min,5min),得到脫蛋白液。(4)西瓜蛋白酶脫蛋白液的制備苦瓜多糖溶液(50ml),調(diào)pH值至6.5,60℃下放置1h后,用1.25%(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒溫5h后,離心(4000r/min,5min),得上清液,上清液再經(jīng)Seveage法脫蛋白,反復(fù)進(jìn)行3次至無(wú)蛋白層,得到脫蛋白液。(5)脫蛋白液的制備苦瓜粗多糖溶液(50ml)+1mol/L鹽酸溶液,調(diào)pH值至3,4℃下放置12h后,離心(4000r/min,5min),得到脫蛋白液。1.2.3測(cè)試(1)測(cè)定了蛋白質(zhì)含量以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定。(2)測(cè)定了杏仁的糖含量以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用蒽酮-濃硫酸法測(cè)定。測(cè)定脫蛋白后各多糖溶液中多糖含量、蛋白質(zhì)含量,然后計(jì)算蛋白清除率和多糖損失率。2結(jié)果與分析2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有紫外分光光度法、Lowry法、雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)法?？紤]考馬斯亮藍(lán)法具有使用方便、反應(yīng)時(shí)間短、染色穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)等特點(diǎn),筆者選用其作為蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?其結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,做標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0052X-0.0023,R2=0.9972,由圖1可見(jiàn),標(biāo)準(zhǔn)品在0～100μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。此法試劑配制簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便快捷,反應(yīng)靈敏,適合苦瓜粗多糖溶液中蛋白質(zhì)含量的定量分析。2.2操作次數(shù)對(duì)多糖去除率和多糖損失率的影響由于苦瓜粗多糖中蛋白質(zhì)含量高,Seveage法脫蛋白過(guò)程中需反復(fù)處理1～6次,分別測(cè)定每次脫蛋白粗多糖溶液中的蛋白及多糖含量,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),隨著操作次數(shù)的增加,蛋白質(zhì)去除率也增加,3次后,蛋白質(zhì)去除率即可達(dá)到50%以上;但操作次數(shù)的增加也會(huì)導(dǎo)致多糖的損失,3次后多糖損失率已達(dá)50%,其原因是每次除去蛋白質(zhì)變性膠狀物時(shí),不可避免地裹脅了部分多糖,另外那些與蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白聚糖和糖蛋白在處理時(shí)也可能會(huì)沉淀下來(lái),從而造成了多糖損失。因此,采用Seveage法除蛋白,反復(fù)處理5次時(shí),脫蛋白效率相對(duì)較高,但多糖損失率也較高,要將其控制在較理想的范圍較為困難。2.3果汁多糖的脫蛋白試驗(yàn)結(jié)果酶法脫蛋白是利用酶的作用使蛋白質(zhì)變性沉淀而分離。分別添加濃度為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%和2.00%(V/V)的木瓜蛋白酶于苦瓜粗多糖溶液中,測(cè)定脫蛋白后的蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率。木瓜蛋白酶法脫蛋白的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,隨著木瓜蛋白酶濃度的升高,蛋白質(zhì)去除率明顯增加,但是當(dāng)用量達(dá)到1.25%后,蛋白質(zhì)去除率效果變化不明顯,此時(shí)其蛋白質(zhì)去除率約為50%;另一方面,木瓜蛋白酶濃度對(duì)多糖損失影響不大,損失率均較低,最高時(shí)僅為11.6%。綜合考慮,選擇木瓜蛋白酶的用量為多糖體積的1.25%較為合理。2.45果汁蛋白脫除率及多糖損失率該試驗(yàn)對(duì)鹽酸法和三氯乙酸法脫蛋白效果進(jìn)行了研究,其脫蛋白率和多糖損失率見(jiàn)圖4。由圖4可知,5種方法對(duì)苦瓜粗多糖提取液中蛋白質(zhì)的脫除效果存在明顯差別,脫除率由大到小依次為:Seveage法(操作6次)>酶+Seveage法>鹽酸法>三氯乙酸法>酶法。Seveage法與酶+Seveage法在蛋白質(zhì)脫除率方面的差別不大,都達(dá)到75%以上。5種方法中多糖損失率由低到高依次為:三氯乙酸法<酶法<酶+Seveage法<鹽酸法<Seveage法。由此可見(jiàn),鹽酸法脫蛋白效果較好,但多糖損失率仍較高(48.2%)。此外,鹽酸為強(qiáng)酸,若實(shí)驗(yàn)條件未得到嚴(yán)格控制,經(jīng)鹽酸脫蛋白后,部分多糖很可能會(huì)降解。Seveage法脫蛋白,需要重復(fù)進(jìn)行多次才能有較好的脫除效果,經(jīng)6次處理后,蛋白質(zhì)去除率達(dá)78.8%,而多糖損失率也高至60.8%。三氯乙酸作為一種有機(jī)酸,能使蛋白質(zhì)變性沉淀,以達(dá)到脫除蛋白質(zhì)的目的,但蛋白質(zhì)去除率不高,僅50.8%。采用酶法和Seveage法結(jié)合使用的方法,既可以有效地脫除蛋白質(zhì),又能較好地保留多糖。經(jīng)木瓜蛋白酶處理后,絕大部分游離蛋白質(zhì)及部分與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)被水解,因此多糖沉淀中蛋白質(zhì)的含量大為降低,且酶解后只需用Seveage試劑處理1～2次即可將蛋白質(zhì)有效除去,從而能減少多糖的損失。因此,酶和Seveage相結(jié)合法是比較理想的脫蛋白方法。2.5紫外-可見(jiàn)吸收光譜采用酶法和Seveage法結(jié)合脫蛋白。取脫蛋白前后的粗多糖在200～400nm做紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,未經(jīng)除蛋白處理的苦瓜粗多糖溶液在280nm處有明顯的蛋白特征吸收峰,而脫蛋白后在280nm處無(wú)特別明顯吸收峰,說(shuō)明酶法和Seveage法結(jié)合脫蛋白的效果顯著。3脫蛋白法或酶法近年,植物多糖的藥理作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。但是,在研究植物多糖過(guò)程中,植物蛋白常影響植物多糖純度,以致其藥理研究出現(xiàn)較大差異。所以多糖脫蛋白是多糖純化的關(guān)鍵。該試驗(yàn)結(jié)果表明,在Seveage法脫除蛋白質(zhì)過(guò)程中,蛋白質(zhì)與糖的變化趨勢(shì)相同。在脫除蛋白質(zhì)的同時(shí),多糖中的糖隨之損失,蛋白質(zhì)和糖損失變化趨勢(shì)十分相似。此外,Seveage法脫蛋白使用的試劑是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物質(zhì),容易造成多糖活性下降和溶劑殘留,可能影響其生物活性的研究,此方面仍需深入研究。值得注意的是,無(wú)論采用哪種脫蛋白方法,所得的多糖制品中都仍存在著20%以上的蛋白質(zhì)成分。這可能