熒光技術(shù)與生命科學(xué)專家簡介：阮康成中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所副所長、研究員、博士生導(dǎo)師，中國生物物理學(xué)會副理事長，上海市政協(xié)科教文衛(wèi)體專業(yè)委員會副主任，九三學(xué)社上海市委科技工作委員會主任。專家簡介：阮康成中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所副所長、研究員、博士生導(dǎo)師，中國生物物理學(xué)會副理事長，上海市政協(xié)科教文衛(wèi)體專業(yè)委員會副主任，九三學(xué)社上海市委科技工作委員會主任。1969年畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系，1981年中科院上海生化所研究生畢業(yè)。阮康成：我今天要講的熒光光譜學(xué)和生命科學(xué)。生命科學(xué)這幾年非常熱門，其原因無非是這幾條，一、它是既老又很年輕的科學(xué)，生命科學(xué)還有很多奧秘沒有被揭開，隨著社會的發(fā)展，生命科學(xué)的很多問題被揭示了，所以人們對它產(chǎn)生了興趣；二、生命科學(xué)與人類的健康、壽命是緊密相關(guān)的。人類對生命科學(xué)巨大的成就，比如說人類基因組、還有一些重大疾病的揭示都比較了解了，但是我看了以前的科普報告，對生命科學(xué)是如何做的，用了其它學(xué)科的什么方法，什么技術(shù)來做這方面講的不多。所以，我今天想結(jié)合我自己的研究，給大家介紹生命科學(xué)中如何用到熒光技術(shù)。我們這里講的熒光與日常生活中看到的、遇到的熒光是不完全一個概念。首先我們看湖南衛(wèi)視《超級女生》視頻，臺下觀眾手中揮舞的熒光棒，還有大家所熟知的螢火蟲發(fā)的熒光，還有節(jié)能燈發(fā)出的熒光，這是平時一般意義上的熒光，與我們現(xiàn)在所講的熒光是不完全一樣的。生命科學(xué)中所講的熒光是指當(dāng)用一定波長的光去照射熒光物質(zhì)時，或者用我們的話來說去激發(fā)這個熒光物質(zhì)時，這個物質(zhì)就會發(fā)出與激發(fā)光顏色不同的光，我們把這種光叫熒光。而且有個特點：這個物質(zhì)發(fā)出的光的顏色用波長來講，要比激發(fā)它的光的波長要長，這就是生命科學(xué)中用的真正的熒光。而剛才前面所講的螢火蟲等發(fā)出的光，我們稱為生物發(fā)光，而熒光棒發(fā)出的熒光，我們稱為是化學(xué)發(fā)光，兩者概念是不一樣的。講到熒光，首先要回顧一下它的發(fā)展史。我們講的熒光早在十六世紀(jì)就在一種螢石的石頭上被人們發(fā)現(xiàn)了，螢石也就是氟化鈣，當(dāng)光照射到石頭上時它會發(fā)出綠色的光，因為螢石的英語是fluorite，因此當(dāng)時英文把它改為fluorescence，就是熒光。我覺得，我們中文翻譯的非常確切的。因為我也沒有考古過，所以，不知道我國是從什么時候開始叫螢石的。有人講我國古代的夜明珠就是螢石，到底是不是，我不知道，一會我講熒光機制的時候，大家可以有個判斷。螢石在裝飾品工藝上用的很多。直至19世紀(jì)五十年代，由英國皇家學(xué)會的Stock院士才真正闡述清楚熒光是怎樣發(fā)生的。他做了一個非常漂亮的實驗，大家都知道金雞納霜里的有效成分是硫酸奎寧，他把硫酸奎寧溶解在稀硫酸里，放到一個瓶子里，然后用太陽光來照這個溶液，但不是直接照射，而是在當(dāng)中用一塊教堂窗上藍色的玻璃（能透過400毫微米以下的短波長的光一一紫外光），也就是說，用太陽光中的紫外光或者近紫外光來照射奎寧硫酸溶液，中間還放置一個黃色的葡萄酒，這杯酒起到的作用是能把400毫微米以上的光都濾掉，只允許400毫微米以上的光透過，他就在90度的角度上來觀察，這樣他就能很清楚地看到，奎寧在用400毫微米以下的光照射時，或者講在激發(fā)時，發(fā)出的是藍色的光，藍色光的波長要比紫外光的波長長。因此Stock就第一個把熒光發(fā)生的過程的道理很清楚的講出來了，而且發(fā)射波長要比激發(fā)波長長，我們把波長之間的差叫作Sock位移（Sockshift），以次紀(jì)念他的貢獻。實際上這個裝置就是最最原始的熒光儀器。用我們現(xiàn)在時髦的話來講，這就是原始創(chuàng)新。到了二十世紀(jì)，隨著人們對量子電子學(xué)的了解，人們對熒光產(chǎn)生的機理就更加清楚了。熒光到底是如何產(chǎn)生的呢？從量子電子角度來講，對能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)，其分子里的電子在一般情況下是處在基態(tài)，或者說穩(wěn)定狀態(tài)（非激發(fā)狀態(tài)），當(dāng)用一定波長的光（不同物質(zhì)需要不同的光），來照射熒光分子時，處于基態(tài)的電子就被激發(fā)到比較高的能級上去，這個時間是非常快的，大概在10-15秒，比微微秒還要快1000倍的速度?；鶓B(tài)的電子就被激發(fā)上去了，激發(fā)上去的電子很快要回到第一單行激發(fā)態(tài)，這個時間需要10-10-10-11秒，然后所有的電子都會回到第一單線激發(fā)態(tài)的最低能級，這個時候電子就面臨這幾種不同的命運：一種是無功而反，另一種是它從單線態(tài)到三重態(tài)，又可以回到基態(tài)，這個時候發(fā)出的光我們叫做磷光。我們所感興趣的第三部分的電子，它是通過發(fā)光的方法回到基態(tài)的各個不同的振動能級，這個就是我們感興趣的熒光。因為都從這兒起始后回到不同的能級，它的能量是不一樣的，我們知道能量不一樣，波長就不一樣。光子的能量是波長越長能量越小，反之波長越短能量越強，所以說熒光的波長肯定要比發(fā)射光的波長要長。我這里要埋下一個伏筆，熒光的發(fā)射時間，準(zhǔn)確的講叫熒光壽命，它只是在10-9-10-7秒，現(xiàn)在找到熒光是這樣產(chǎn)生的。熒光中有很多重要的熒光參數(shù)和概念，包括熒光強度、熒光激發(fā)譜和發(fā)射譜、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振、熒光淬滅、能量轉(zhuǎn)移、熒光總量、譜寬、Stock’s位移等，由于我們不是作學(xué)術(shù)報告，所以不做深入講解了。我們知道了熒光是怎么產(chǎn)生的，那么什么樣的物質(zhì)有熒光呢？我們知道生物大分子有三類，蛋白質(zhì)、核酸、生物膜。據(jù)我所知，核酸里面有些核甘酸是有熒光的，但是其熒光非常非常弱，所以，一般不去做核酸的熒光。生物膜也是如此。在生物學(xué)里，蛋白質(zhì)的組成部分非常有意思，常見的蛋白質(zhì)有20種氨基酸通過一定的方式組成，其中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸，能產(chǎn)生熒光。從它們的分子式里看出，這三種氨基酸都有苯環(huán)，它們各有各的特征。酪氨酸常常做無名英雄，它單獨存在或者以氨基酸存在的時候，它的熒光發(fā)射能力要比色氨酸強的多，但在蛋白質(zhì)里同時有色氨酸和酪氨酸時，酪氨酸就變成了"無名英雄”，它的熒光就不出來了，只有色氨酸能發(fā)處熒光。圖中，人的血清白蛋白中只有1個色氨酸，有16個酪氨酸，照例講，發(fā)熒光應(yīng)該以酪氨酸為主，色氨酸為次，其實不然，只能測出色氨酸的熒光。我們把生物中諸如蛋白質(zhì)這種本身就能發(fā)出熒光的物質(zhì)叫做內(nèi)源熒光，色氨酸處于蛋白質(zhì)的位置不同，產(chǎn)生的熒光光譜也是不同的。就此，我們把色氨酸作為報告基團，你有什么樣的光譜反過來我們就知道色氨酸處于什么位置，因此我們在生物學(xué)中就把熒光發(fā)生團叫做探針，也叫報告基團。這樣的色氨酸就可以用來研究蛋白質(zhì)的折疊和去折疊。蛋白質(zhì)是由許多氨基酸組成的一條長鏈，如果它處于無規(guī)則狀態(tài)下，它是不具有任何功能的，它只有通過一系列的變化，在高級結(jié)構(gòu)下才具有它的功能。我們把這個過程叫做折疊，因此，我們可以用這樣的方法來研究它。比方說有一種叫33K的蛋白（因為它的分子量是33K），這個蛋白對植物光合作用的電子傳遞的穩(wěn)定性起到非常大的作用，33K蛋白里面恰恰只有一個色氨酸，便于我們研究。所以我們通過一定的物理化學(xué)方法讓它的色氨酸從里面慢慢地跑到外面來，這就是用生物學(xué)的解折疊的方法使其中唯一的色氨酸融解到水溶液當(dāng)中去，變換它的光譜并還原，就可以探測到這個色氨酸是如何解折疊的。再比如人體內(nèi)的鈣條蛋白，它對運輸鈣離子起重要作用，這個蛋白質(zhì)里一個色氨酸都沒有，但它有四個鈣離子結(jié)合的部位，我們在每一個結(jié)合部位把氨基酸換成色氨酸，每次換一個，其余三個保持原狀，從而測出鈣離子的四個結(jié)合部位蛋白中的特點。剛才我們簡單的講了講上帝給我們的色氨酸研究蛋白的方法。測熒光一定要有儀器，剛才我們講的Stock發(fā)明的是第一臺最原始的儀器，我們現(xiàn)在用山燈代替太陽，山燈會發(fā)出非常強大的寬光譜光源，然后通過一個單色儀，把山燈發(fā)出的光分成一束一束的單色光。這里的山燈就好比是太陽，而單色儀就好比是教堂的玻璃片。現(xiàn)在雖然儀器現(xiàn)代化了，但還是脫離不了Stock設(shè)計的模式，只不過裝置復(fù)雜了一點。這里我特別要介紹一位先生：美國科學(xué)院院士、阿根廷人Dr.GregorioWeber，他是發(fā)現(xiàn)色氨酸中有熒光的第一人。他和我們所原來的副所長曹天欽先生是劍橋大學(xué)的同學(xué)，他有一句話說得非常好，他認(rèn)為你能用好的儀器出好文章和成果，當(dāng)然是好事情，但是你單單靠好儀器，那不是真正的成就。如果你能用一般的儀器做不是最先進儀器，研究出漂亮成果的，那才是真正的成就。說到這里讓我聯(lián)想到，我們國家有時不計成本進口儀器的事，曾經(jīng)發(fā)生過有一種儀器全球只生產(chǎn)了5——6臺，而我們國家卻占了一半。國外科學(xué)家到我國一看，感到吃驚，你們的儀器那么好，但工作卻不是這樣。這是題外話。剛才我們講的是用蛋白質(zhì)本身的熒光來研究它的功能，它的構(gòu)象，這是遠遠不夠的，所以在生命科學(xué)研究中人們想出了個辦法，不單單用本身固有的，還可以用外來的，進行創(chuàng)造性的工作。比如人體本身具有血紅蛋白，它可以把肺里的氧氣傳輸?shù)缴眢w各個部位。從分子結(jié)構(gòu)上來講，正常人的血紅蛋白有兩個a亞基和兩個R亞基，但如果是血紅蛋白分子病的人，那么，他的R亞基里的氨基酸發(fā)生突變，由谷氨酸變成纈氨酸，非洲人得這種鐮刀型血紅蛋白癥比較多，得了這種病以后，其紅細胞形狀改變成鐮刀狀，一般只能活到30歲左右。這種病我們國家還沒有發(fā)生。下面這個例子就發(fā)生在上海的，這種病不是R亞基出問題，而是其a亞基出現(xiàn)問題，其中第87號氨基酸（我們稱為組胺酸）變成了酪安酸，從而該病人的血紅蛋白攜氧能力就很弱，其病癥是嘴唇發(fā)紫、指甲發(fā)青。我們知道了這個病人的病理情況，即他這個氨基酸取代了，那么為什么一個氨基酸被取代會發(fā)生這樣的情況呢？我們就設(shè)想是不是其鐵普林出了問題，因為真正帶氧的是鐵普林中的鐵離子的一個配位鍵，所以我們嘗試放入外源的1,8ANS熒光探針，其實它就是我們通常使用的樟腦丸一一奈的一種衍生物，這個探針專門結(jié)合到蛋白的"疏水部分”。1,8ANS探針有個特性，它的熒光特性與環(huán)境息息相關(guān)，比如熒光壽命，隨著疏水性能的增強而增強。所以，我們可以倒過來通過測其熒光壽命來反推它的疏水特性。另一個是產(chǎn)生熒光的本領(lǐng)，本領(lǐng)越強，熒光越強。我們想辦法把四個亞基分開，然后用生化的方法非常溫和地把鐵普林拿走，得到?jīng)]有輔基的蛋白亞基，從而測出是否得病。正常人的熒光壽命為12.9ns相當(dāng)于在辛醇中的壽命，而得病的人為8.0ns相當(dāng)于在乙醇中的壽命，那么顯然得病的人其疏水能力比正常人弱的多，所以攜氧的能力就弱。再舉一個用外源熒光探針來研究生物大分子的例子，人們早就知道有一種生物大分子叫ATP合成酶，它會轉(zhuǎn)動，像一個不知疲倦的馬達，之前始終沒有確切的證據(jù)來證實其旋轉(zhuǎn)的特性，直到前幾年有人利用外源熒光探針來揭示其馬達的特性。他把酶的上半部分固定到玻璃片上，把它的亞基連上一根肌動蛋白組成的非常細的纖維，標(biāo)上熒光探針，在顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一加ATP時，它就轉(zhuǎn)動了，當(dāng)ATP用完，它也就不轉(zhuǎn)了，如果再加ATP的話，它又會轉(zhuǎn)。這就是真正的一個分子的ATP酶轉(zhuǎn)動的情況，從而看出熒光方法的優(yōu)勢。這是一個模型，我們知道人的肌肉的收縮主要由兩大部分組成：一、肌動蛋白組成一個纖維，二、肌球蛋白，通過這兩個蛋白的配合，一動一動肌肉就收縮了。這里也有用熒光技術(shù)的。下面講一下非常有趣的綠色熒光蛋白，這個蛋白除了有色氨酸、纈氨酸外，還自身特別形成了一個發(fā)射團，這個蛋白來自于海水中的水母，其中有三個氨基酸，通過氧化以后形成這樣一個發(fā)射團，這是它的結(jié)構(gòu)示意圖，猶如一個花籃，其發(fā)射團就在中間。目前發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白包括綠、青、黃、紅色。綠色熒光蛋白是很有用的，一個可以做報告基因。大家都知道，我們可以用基因工程的方法，把一些基因插入到我們感興趣的生物中去，然后讓它表達。到底表不表達，一般很難知道，有了綠色熒光蛋白后，我們可以把綠色熒光基因和要表達的基因連在一起，要表達就兩個一起表達，綠色熒光蛋白很容易識別，一下就能看出，只要綠色熒光蛋白表達了，那么那個基因也表達了。這是美國密蘇里大學(xué)做的轉(zhuǎn)基因豬，最近通過克隆技術(shù)培育出四只含有熒光水母基因的小豬，證明轉(zhuǎn)基因豬是可以傳代的。利用熒光蛋白可進行能量傳遞，如果兩個蛋白分別連上綠色和紅色熒光蛋白，一旦將兩分子結(jié)合，用藍光照射綠色熒光蛋白，結(jié)果看不到綠光，看到的是紅光，相當(dāng)于綠色熒光蛋白把能量吸過來，然后無輻射轉(zhuǎn)移給另外一個熒光蛋白，我們把這兩個蛋白稱為供體和受體。這種圖很形象，供體和受體之間距離越小，轉(zhuǎn)移效果越大，也就是說轉(zhuǎn)移效率與兩體之間距離成反比，用此可測量生物大分子間的距離。比如說人們感興趣的麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP），利用這個方法就可以很清楚的測出這個麥芽糖結(jié)合部位到那個大分子間的距離。另外利用能量轉(zhuǎn)移的有無，也可以看出蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間是否有相互作用。利用熒光技術(shù)還可對基因表達產(chǎn)物進行定位，2001年，我國實驗性微生物學(xué)研究成果首次在美國《Science》上刊登，就是由我們所的張永連院士在小鼠的附睪當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了B1b這個基因，這個基因可以殺死細菌，我們用熒光技術(shù)準(zhǔn)確定位該基因在附睪中的定位。熒