1第一節(jié)DNA重組的基本原理第二節(jié)工具酶第三節(jié)DNA分子的片段化第四節(jié)DNA片段的體外連接第二章DNA重組2生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程與發(fā)酵工程等。目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA；②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）?；蚬こ?geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。第一節(jié)DNA重組的基本原理3應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。

DNA重組原理4DNA重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價連接形成重組DNA分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段5發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。同源重組6限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶

DNA修飾酶

DNA連接酶核酸外切酶單鏈DNA內(nèi)切酶第二節(jié)工具酶7重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基8一、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease）（一）限制性內(nèi)切酶的定義GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ9一把特殊的剪刀

——限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。10DNA限制性內(nèi)切酶112.性質(zhì)內(nèi)切酶。原核生物。即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。自我保護作用。3.功能細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源12限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）13細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基1415I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。（二）限制性內(nèi)切酶的類型II型限制性內(nèi)切酶III型限制性內(nèi)切酶16首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。（1）識別位點序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性內(nèi)切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修飾的特異序列。17需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用機理在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位點18首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與DNA的來源無關。2.II型限制性內(nèi)切酶分離的第一個酶是HindⅡ。19Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

形成末端：平齊末端、粘性末端GGATCCCCTAGG20EcoRI5ˊ-G

AATTC-3ˊ

3ˊ-CTTAA

G-5ˊPstI5ˊ-CTGCA

G-3ˊ

3ˊ-G

ACGTC-5ˊ

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5ˊ-GAT

ATC-3ˊ3ˊ-CTA

TAG-5ˊ

產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識別位點處。21（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5ˊ端凸出（如EcoRI切點）G

AATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAA

G5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊ5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊ22CTGCA

G

②3ˊ端凸出（如PstI切點）G

ACGTC5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊ5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊCTGCAG

GACGTC23

①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個平齊末端容易的多。2425③補平成平齊末端凸出的3ˊ端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5ˊ末端標記凸出的5ˊ末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。26識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5ˊ

-A

AGCTT-3ˊ

3ˊ

-TTCGA

A-5ˊHsuI5ˊ

-A

AGCTT-3ˊ

3ˊ

-TTCGA

A-5ˊ27GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2829XmaI5ˊ

-C

CCGGG-3ˊ

3ˊ

-GGGCC

C-5ˊSmaI5ˊ

-CCC

GGG-3ˊ3ˊ

-GGG

CCC-5ˊ識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：30識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5ˊ

-G

GATCC-3ˊ

3ˊ

-CCTAG

G-5ˊBamHIBclI5ˊ

-T

GATCA-3ˊ

3ˊ

-ACTAG

T-5ˊ

5ˊ

-A

GATCT-3ˊ

3ˊ

-TCTAG

A-5ˊBglⅡ5ˊ

-U

GATCY-3ˊ

3ˊ

-YCTAG

U-5ˊ

XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。315ˊ

-

GATC----3ˊ

3ˊ

----CTAG

-5ˊ

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5ˊ

-G3ˊ

-CCTAGGATCT-3ˊ

A-5ˊBamHIBglⅡ5ˊ

-GGATCT-3ˊ

3ˊ

-CCTAGA-5ˊBamHIBglⅡSau3A3233限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。（7）限制酶的酶活性如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應緩沖液。①星號（*）活性34EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時候要特別注意！353.Ⅲ型限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點切割DNA，但反應需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG36核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性I型內(nèi)切酶II型內(nèi)切酶III型內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG37切割位點在距離識別位點至少1000bp處隨機切開一條單鏈。位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3‘端24—26bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用381973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：（三）限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。394.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。2.

用一個右下標的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬數(shù)字表示。如EcoRI，EcoRV。40第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶41DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1.DNA的純度（四）影響限制性內(nèi)切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量③延長保溫時間④擴大反應體積（>20

l）一般采取42大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCATGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木辍?3不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求25-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.溫度44是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。45（五）限制性內(nèi)切酶對DNA的消化1.內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG46內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。2.完全消化1234123447只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。3.局部消化12341448大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活?；蛴靡掖汲恋鞤NA。4.限制酶酶切反應的終止5.幾種常用限制酶識別位點4950（一）基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶7.TaqDNA聚合酶二、DNA聚合酶511.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加上千個dNTPs而不從模板上掉下來。有幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。（二）常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。52DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較53（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5ˊ

3ˊ外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5ˊ

3ˊ外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。54①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應條件-OH5ˊ3ˊdNTPs55標記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列雜交56標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5ˊ3ˊ57③DNA聚合酶I對探針序列的標記切口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標記：DNA聚合酶I同時具備5ˊ

3ˊ外切酶活性和5ˊ

3ˊ的聚合酶活性（以及3ˊ

5ˊ外切酶活性）。585ˊ

3ˊ外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5ˊ端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3ˊ一側(cè)補上一個新的核苷酸。切口切口5ˊ5ˊ3ˊ3ˊ5ˊ3ˊ5ˊ3ˊ59純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈切口DNAPolI進行切口轉(zhuǎn)移一種

-32P-dNTP5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記602.Klenowfragment具有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性。（失去了5’

3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolI

Klenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶61①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途623’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根據(jù)末端的順序選擇一種

-32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI

-32P-dATP

-32P-dGTP25oC1h63③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物64（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性65③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’

5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。665’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’67（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’

5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’

3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。①補平隱蔽末端②DNA3’末端標記68酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’

5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’

3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內(nèi)切酶切無dNTPs694.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’

3’聚合酶和3’

5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：增加大亞基對模板的親和性。70（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。②3’

5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙。71②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。725.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去除3’

5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測序：雙脫氧法；②標記DNA3’隱蔽末端；③更有效地補平末端。736.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由

和

兩條多肽鏈組成。74①

鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：

鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以5’

3’或3’

5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA75（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途②

鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’

3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結(jié)合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA76②合成DNA探針用隨機引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機引物：隨機順序形成的寡聚DNA片斷。7.TaqDNA聚合酶77（一）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個亞基。3.特性（1）5’

3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）三、DNA修飾酶78②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲砷酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA。④隨機添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉(zhuǎn)移酶79（2）再生酶切位點便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補平80AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNA81（3）非放射性標記DNA片斷的3’端AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點HindⅢ位點連接催化非放射性標記物參入DNA片斷的3’端。82（二）T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化

磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。835’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的

磷酸帶有32P標記，就會被轉(zhuǎn)移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。843.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(

-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應（forwardreaction）85（2）交換反應標記法反應混合物中具有超量(

-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(

-32P)ATP的

-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(

-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應效果不理想。86（三）堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。872.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體分子自我連接88單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’89A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。9091ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個nick，但轉(zhuǎn)入細菌后會被修復。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA92從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。（一）DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復制一定有斷口。四、DNA連接酶93（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。（二）DNAligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。94（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件951.ATP（NAD+)提供激活的AMP。（三）連接反應的機理2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸

-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi964.AMP隨后從連接酶的賴氨酸

-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP975.3’-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，釋放出AMP。98連接酶反應的最佳溫度是37

C。（四）連接反應的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實用溫度所以一般采用4~16

C。99增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應溫度4℃。（五）影響連接反應的因素10~20倍。100101102是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。（一）單鏈DNA外切酶1.大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’

3’外切識別5’-OH2.大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’

3’、3’

5’外切識別3’-OH、5’-P五、核酸外切酶（Exonucleases）103（二）雙鏈DNA外切酶1.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’

5’外切識別3’-OH主要用途：在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。5’5’5’5’exoⅢ與klenow配合進行3’端標記-OHHO-1042.

核酸外切酶（

exo）5’

3’外切。主要用途：使DNA雙鏈變成單鏈（短）。5’P--P5’5’5’

exo成為測序模板。識別5’-P（但不能降解5’-OH）105（一）S1核酸酶1.來源稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）。2.特性（1）高度單鏈特異性（2）反應條件①低水平Zn2+②pH4.0~4.3六、單鏈DNA內(nèi)切酶1063.S1核酸內(nèi)切酶的功能（1）催化單鏈RNA或DNA降解。（2）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)。S1S1發(fā)卡或有缺口的部位。107ATGCATGCATGCTACGTACGTACGT甚至能識別單個核苷酸的單鏈區(qū)?。?）降解限制酶切形成的單鏈突出端。1084.S1核酸酶的用途（1）定位RNADNARNAS1S1200bp400bp某限制酶切后再與RNA雜交某限制酶位點（參照物）內(nèi)切酶位點不能位于內(nèi)含子序列中！RNA109RNA位于某限制酶位點左200bp和右400bp。RNA位置不能配對的內(nèi)含子區(qū)域形成的單鏈環(huán)被S1切掉。mRNADNA（2）用mRNA測定基因中的外顯子序列110一、DNA分子的酶切

1.單酶切法；2.雙酶切法；3.部分酶切二、DNA分子的限制性圖譜

1.雙酶切法；2.部分酶切法第三節(jié)DNA分子的片段化111單酶切法是DNA片段化最常用的方法，用一種限制性內(nèi)切酶切割D