拼搏進(jìn)取第十八章紫外—可見(jiàn)吸光光度法教學(xué)要求：1、了解紫外—課件吸光光度法特點(diǎn)。2、掌握光的吸收定律及適用范圍。3、掌握紫外—可見(jiàn)吸光光度法的分析方法。4、了解顯色反應(yīng)及其條件的選擇。5、了解紫外—可見(jiàn)吸光光度法儀器測(cè)量的誤差及測(cè)量條件的選擇。6、了解紫外—可見(jiàn)分光光度法在生物學(xué)中的應(yīng)用。7、了解分子熒光分析法。第十八章紫外—可見(jiàn)吸光光度法18—1概述一、吸光光度法1、定義：基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法。它包括比色法，可見(jiàn)分光光度法及紫外分光光度法。2、特點(diǎn)：（1）靈敏度高：10-5~10-6，10-7~10-8，10-10

mol·L-1，（2）準(zhǔn)確度高：比色分析，相對(duì)誤差5~10%，分光光度法，2~5%，1~2%；（3）應(yīng)用廣泛：可測(cè)定幾乎所有無(wú)機(jī)物和許多有機(jī)物；（4）操作簡(jiǎn)便儀器設(shè)備易普及。二、光的基本性質(zhì)1、光是什么：光是一種電磁波，具有波粒二像性。λν=c，E=hν=hc/λ。單色光，復(fù)合光三、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收1、吸收光譜的產(chǎn)生：

原子吸收光譜：原子外層電子選擇性吸⑴吸收光譜

收某些波長(zhǎng)電磁波，線光譜

分子吸收光譜：帶光譜⑵分子振動(dòng)能級(jí)：分子內(nèi)部?jī)r(jià)電子運(yùn)動(dòng)，分子內(nèi)原子振動(dòng)和分子饒其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)。⑶分子能量：E=Ee+Ev+Er⑷分子吸收光譜產(chǎn)生：分子吸收外界能量（光、電、熱）引起分子能級(jí)躍遷，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)ΔE=E1－E2=hν==hc/λ電子躍遷能級(jí)較大，能量在1~20eV,紫外可見(jiàn)吸收光譜在200~780nm紅外吸收光譜法：吸收光波長(zhǎng)范圍2.51000m,主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

紫外吸光光度法：吸收光波長(zhǎng)范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析?？梢?jiàn)吸光光度法：吸收光波長(zhǎng)范圍400750nm，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。

本章主要討論可見(jiàn)吸光光度法。在光譜分析中，基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法稱為吸光光度法,依據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)范圍光的吸收，主要有:⑸物質(zhì)的顏色：由于不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同具有不同量子化能級(jí)，產(chǎn)生的吸收不同。其顏色和光的吸收、透過(guò)、反射有關(guān)。①互補(bǔ)色光：把兩種適當(dāng)顏色的光按一定的強(qiáng)度比例混合，成為白光，稱為互補(bǔ)色光。②無(wú)色：對(duì)光譜中各種色光透過(guò)程度相同。③有色：物質(zhì)的顏色由它透過(guò)或反射的光決定。④黑色:幾乎吸收所有的入射光。⑤白色:幾乎全部反射入射光。3、吸收曲線：測(cè)量某種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)單色光的吸收程度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到的一條吸收光譜曲線。（1）用途：①進(jìn)行定性分析；②進(jìn)行定量分析；③選擇吸收波長(zhǎng)；④判斷干擾情況。1、透光率T與吸光度A一束平行單色光照射溶液時(shí)，光的一部分被吸收，一部分透過(guò)溶液，一部分被器皿的表面反射。Io=I

+Ia+Ir若入射光強(qiáng)度為Io，吸收光的強(qiáng)度為Ia，透過(guò)光強(qiáng)度為I，反射光的強(qiáng)度為Ir，它們的關(guān)系是Io=I

+Ia在吸光光度法中，測(cè)定時(shí)都是采用同樣材質(zhì)的比色皿，反射光的強(qiáng)度基本上是不變的，約占4％，其影響可以相互抵消，上式可簡(jiǎn)化為：透過(guò)光強(qiáng)度I與入射光強(qiáng)度Io之比稱為透光度或透光率。用T

表示：從上式可以看出：溶液的透光度越大，說(shuō)明對(duì)光的吸收越小，濃度低；相反，透光度越小，溶液對(duì)光的吸收越大，濃度高。

18-2光的吸收定律一、朗白-比爾定律1、朗白定律（Lambert’sLaw）：1729Bougure,1760Lambert通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電磁能被物質(zhì)吸收時(shí)，透過(guò)能量呈指數(shù)減少。假定一輻射能通過(guò)光路后被吸收25%，再通過(guò)下一個(gè)光路時(shí)被吸收0.75×25%，剩56.25%，依次類推，在無(wú)限大的光路中將吸收全部輻射能寫成指數(shù)形式T=I/I0=10-kbT稱為透光率lgT=lgI/I0=-kb

Lambert’sLaw2、比爾定律(Beer’sLaw):1852BeerandBermard發(fā)現(xiàn)類似定律，T和吸光物質(zhì)的濃度有關(guān)：T=I/I0=10-k’clgT=lgI/I0=-kcBeer’sLaw3、朗白比爾定律：合并上述兩個(gè)定律為比爾定律T=I/I0=10–abca是k和k’合并常數(shù)lgT=lgI/I0=-abcA=-lgT=lg1/T=lgI0/I=abc,a是吸光系數(shù)A是吸光度，大小取決于波長(zhǎng)和吸光物質(zhì)的性質(zhì)如果c以摩爾濃度表示A=κbc，κ單位L·mol-1·cm-1，表示物質(zhì)的量濃度為1mol·L-1，液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。4、κ的含義（也可用ε表示）

（１）κ是吸光物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和物質(zhì)中的特征常數(shù)，反映該吸光物質(zhì)的靈敏度．κ值越大，表示該吸光物質(zhì)對(duì)此波長(zhǎng)光的吸收能力越強(qiáng)，顯色反應(yīng)越靈敏，在最大吸收波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)常以κmax表示；（２）根據(jù)朗伯－比耳定律，κ＝A/bc由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，以總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，κ為表觀摩爾吸收系數(shù)，κ=Ma,M是摩爾質(zhì)量；（３）桑德?tīng)枺⊿andell）靈敏度S儀器檢測(cè)限為A=0.001時(shí)，單位截面積(cm2)光程內(nèi)所含吸光物質(zhì)的最低含量，其單位是μg·cm-2,S=M/κ吸光度A：若光全部透過(guò)溶液，Io=I，A=0。若全部被吸收，I=0，A=∞。吸光度A是用來(lái)衡量溶液中吸光物質(zhì)對(duì)單色光λ

的吸收程度，A值越大，其吸收程度越大；反之亦然。5、A和T的關(guān)系:透光率T=I/I0

A=-lgT=lg1/T=lgI0/I=abcA=-lgT=lg1/T=lgI0/I=εbc百分透光率T%=I/I0×100%A=2.00－lgT%6、例題鐵（Ⅱ）濃度為5.0×10-4

g·L-1

的溶液，與1，10-鄰二氮菲反應(yīng)，生成橙紅色絡(luò)合物。該絡(luò)合物在波長(zhǎng)508nm，比色皿厚度為2cm時(shí)，測(cè)得A=0.19。計(jì)算1，10-鄰二氮菲鐵的a及κ。需要知兩個(gè)公式A=abc以及κ=Ma,解：先求a，再求κ已知M(Fe)=55.85a=A/bc=0.19/2×5.0×10-4=190L·g-1·cm-1κ=Ma=55.85×190=1.1×104L·mol-1·cm-1二.偏離比爾定律的原因1、非單色光引起的偏離嚴(yán)格地說(shuō)，比爾定律只適用于單色光。溶液a和b，ca＞cb，入射光為λ2~λ3一段復(fù)合光，簡(jiǎn)化為λ1λ2的復(fù)合光。從圖，表看出：吸光度產(chǎn)生負(fù)誤差，濃度越高，誤差越大。結(jié)論：用單色光純度高儀器；選最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定；用適當(dāng)?shù)偷臐舛葴y(cè)定。圖9-8復(fù)合光對(duì)比爾定律的影響2、介質(zhì)不均勻引起的偏離：膠體、乳濁液或懸浮物質(zhì)液吸收、散射；3、由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離：物質(zhì)的解離、締合、形成化合物或互異構(gòu)；HAH++A-Cr2O72-+H2O2H++2CrO42-18-3目視比色法及光度計(jì)的基本部件一、目視比色法1、定義：用眼睛比較溶液顏色深淺以測(cè)定物質(zhì)含量的方法。2、測(cè)定方法：標(biāo)準(zhǔn)系列法。3、優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，不要求嚴(yán)格遵守比爾定律。4、用途:用在要求不高的常規(guī)分析中。5、缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度不高，標(biāo)準(zhǔn)系列制作麻煩，容易受干擾。二、分光光度法及光度計(jì)1、分光光度法：使用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定的方法。2、與比色法比較：（1）是用儀器代替人眼進(jìn)行測(cè)量，消除了人的主觀誤差，提高了準(zhǔn)確度；（2）待測(cè)溶液中有其它有色物質(zhì)共存時(shí)，可以選擇適當(dāng)?shù)膯紊夂蛥⒈热芤簛?lái)消除干擾，因而提高選擇性；（3）在分析大批試樣時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以簡(jiǎn)化手續(xù)，加快分析速度。

1、光源：應(yīng)有足夠的發(fā)射強(qiáng)度而且穩(wěn)定，如鎢絲燈、氘燈等。2、單色器：采用棱鏡或光柵獲得單色光。3、吸收池：比色皿，厚度有0.5、1、2、3cm等。4、檢測(cè)器：光電池或光電管。光源單色器檢測(cè)系統(tǒng)吸收池Agilent6010紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)分光光度計(jì)熱電Unicam3、光度計(jì)組成：3、光度計(jì)組成：

光源—單色器—吸收池—檢測(cè)系統(tǒng)(1)光源：要求穩(wěn)定，強(qiáng)度高，常用6~12V鎢絲燈或鹵鎢燈，2600~2870K,發(fā)320nm~2500nm的連續(xù)光譜，可見(jiàn)光部分用其360~800nm;(2)單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，分為棱鏡和光柵兩種；光柵的分辨率比棱鏡大，可用的波長(zhǎng)范圍也較寬。（3）比色皿：也稱吸收池，長(zhǎng)方體，兩面透明，有玻璃和石英玻璃兩種，規(guī)格有0.5，1.0，2.0，5.0cm等；（4）檢測(cè)器：檢測(cè)器的作用是接受從吸收池發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。分為光電池、光電管、光電倍增管和光電二極管陣列。顯示裝置：檢流計(jì)，數(shù)顯，記錄儀，CRT。練習(xí)題1、人眼能感覺(jué)到的光稱為可見(jiàn)光，其波長(zhǎng)范圍是A。400~780nmB。200~320nmC。200~780nmD。200~1000nm答案：A2、符合比爾定律的一有色溶液，當(dāng)其濃度增大時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)和吸光度分別是A。不變，增加B。不變，減少C。增加，不變D。減少，不變答案：A

3、下列表述不正確的是A。吸收光譜曲線，表明了吸光度隨波長(zhǎng)的變化關(guān)系B。吸收光譜曲線中,最大吸收處的波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)C。吸收光譜曲線，以波長(zhǎng)為縱坐標(biāo),以吸光度為橫坐標(biāo)D。吸收光譜曲線，表明了吸光物質(zhì)的吸收特性答案：C4、影響有色物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)的因素是A。吸收池厚度B。入射光波長(zhǎng)C。有色物質(zhì)溶液的濃度D。入射光的強(qiáng)度答案：B5、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當(dāng)其濃度為c時(shí)，用1.00cm比色皿測(cè)得其透光度為T，，當(dāng)濃度減小為0.50c時(shí)，，在同樣條件下測(cè)定，其透光率應(yīng)為A。T2B。2TC。T1/2D。T/2答案：c

lg1/T=εbc6、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在可見(jiàn)區(qū)測(cè)量時(shí)所用光源是A。氫燈B。鎢燈C?？招年帢O燈D。紅外燈答案：

B7、在光度計(jì)的檢流計(jì)上刻有A和T，二者關(guān)系為

8、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當(dāng)其濃度為c時(shí)，吸光度A=0.30，那么當(dāng)濃度為2c時(shí)，該溶液的吸光度A=。A=-lgT

=lg1/T。0.60上課了！大家安靜！18-4顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇顯色反應(yīng)：將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)。顯色劑：與待測(cè)組分形成有色化合物的試劑。一、顯色反應(yīng)的選擇：1、顯色反應(yīng)的類型：配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。2、對(duì)顯色反應(yīng)的要求：⑴靈敏度足夠高:κ＞105超高靈敏，κ=(6~10)104

高靈敏,κ=(2~6)104中等，κ＜2×104不靈敏⑵顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收，試劑空白小。對(duì)比度：兩有色物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)之差Δλ=|λMAXMR-λMAXR|≥60nm⑶有色化合物組成及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定以及選擇性好干擾小。二、顯色條件的選擇1、顯色劑的用量：

M+RMR

待測(cè)組分顯色劑有色配合物2、溶液的酸度：M+HRMR+H+

⑴影響顯色劑濃度和顏色；⑵影響Mn+的存在狀態(tài);⑶影響配合物的組成。顯然，增大酸度對(duì)顯色反應(yīng)不利。3、顯色溫度的選擇：一般在室溫，有時(shí)需加熱，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定4、顯色反應(yīng)時(shí)間：制作吸光度-時(shí)間曲線5、溶劑：降低有色化合物離解度，增加靈敏度如在Fe(SCN)3的溶液中加入與水混溶的有機(jī)試劑（如丙酮），由于降低了Fe(SCN)3的解離度而使顏色加深，提高了測(cè)定靈敏度。6、干擾及其消除：（1）控制溶液酸度；（2）加入絡(luò)合掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑；（3）利用氧化還原反應(yīng)改變離子的狀態(tài)；（4）選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，要求吸收大，干擾??；（5）選擇合適的參比溶液；（6）采用適當(dāng)?shù)念A(yù)先分離的方法。三、顯色劑1、無(wú)機(jī)顯色劑：應(yīng)用不多，因其生成絡(luò)合物不穩(wěn)定，靈敏度選擇性也不高。目前有使用價(jià)值的主要有；硫氰酸鹽：測(cè)定Fe3+、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb5+等。鉬酸銨：測(cè)定P、Si、W等。過(guò)氧化氫：測(cè)定V5+、Ti4+等2、有機(jī)顯色劑：⑴特點(diǎn)：有機(jī)顯色劑大多能與金屬離子生成極其穩(wěn)定的螯合物，具有特征顏色，其選擇性，靈敏度均高。不少螯合物易溶于有機(jī)溶劑，可以進(jìn)行萃取比色。有機(jī)顯色劑多是含有生色團(tuán)和助色團(tuán)的化合物。⑵生色團(tuán)：含有不飽和鍵的基團(tuán)，如-N=N-,＞C=C＜,-N=O,＞C=O,＞C=S、醌基等。⑶助色團(tuán)：某些含有孤對(duì)電子的基團(tuán),它們與生色團(tuán)上的不飽和鍵相互作用,影響其吸收,使顏色加深（紅移）。如-OH,-RH,-NH2,-NHR,-SH,-Cl,-Br,-I等。⑷類型：①偶氮類：偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等；②三苯甲烷類：鉻天青S，二甲酚橙，結(jié)晶紫等；③其它型：OO,NN,含S型等。茜素偶