肝內(nèi)膽管癌動物模型的建立

目前，對肝臟內(nèi)膽管癌（icc）的研究很少，對其缺乏充分的了解。為提高ICC的臨床診治水平,我們對其生物學(xué)特性進行研究,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。材料和方法1.誘導(dǎo)癌藥物氨基比林(aminopyrine),上海試劑一廠生產(chǎn);亞硝酸鈉(sodiumnitrite),重慶北碚化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。2.性別決定5～6周齡的敘利亞地鼠(syrianhamster)70只(蘭州市生物制品研究所提供),均為雄性。分為實驗組50只,對照組20只。兩組飼養(yǎng)條件相同,控制溫度為20～25℃,相對濕度45%～55%,保持環(huán)境清潔,地鼠專用飼料喂養(yǎng),飲用水及飼料新鮮無污染。3.動物飲用水參照Bergman和Wahlin的方法,略加修改,每日以蒸餾水新鮮配制氨基比林和亞硝酸鈉混合溶液,二者濃度均為800mg/L,并調(diào)整pH值至7.0,作為實驗組動物飲用水,每周連續(xù)飲用6d,第7天飲用自來水,連續(xù)飲用24周。對照組動物飲用自來水,所有動物均自由飲水。每隔4周處死實驗動物5～10只,對照組動物2～3只,至第24周處死所有動物,實驗過程中瀕死或死亡的動物立即處死、解剖。4.膽囊及肝外腸道(1)大體觀察:每日觀察動物的精神、飲食及活動情況,動物自然死亡或處死后,立即做尸檢,觀察肝臟的大小、色澤、外形及有無腫瘤結(jié)節(jié)形成。同時觀察膽囊及肝外膽道、胰腺、胃、脾、心、肺、腎等重要臟器的情況。(2)組織學(xué)檢查:取肝臟、膽囊及肝外膽道,12周以后處死/死亡的動物同時取胰腺、肺、胃、腎臟等組織,福馬林固定24～48h,常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后鏡檢,病理診斷主要依據(jù)組織結(jié)構(gòu)及細胞的異型性和浸潤程度。肝內(nèi)有部分病變正常對照組動物肝臟及膽道未見任何相應(yīng)病變。實驗組動物主要病變描述如下:1.早期(8周以前):本期內(nèi)實驗動物無死亡。肝臟的主要改變?yōu)槟[大和淤血。鏡檢見肝細胞變性壞死(因誘癌劑的毒性作用引起),同時可見卵圓細胞增生(9/10)和炎性細胞浸潤,多見于匯管區(qū)。8周時,少數(shù)動物出現(xiàn)小膽管管狀增生(2/10):增生的小膽管多位于匯管區(qū)或大膽管周圍,呈數(shù)量不一簇狀分布,被包圍于纖維組織中。還可見小膽管的囊性增生(1/10):增生的小膽管呈囊狀擴張,形成單個或多個擴張程度不一的小囊,上皮細胞呈扁平狀,單層排列(圖1,2)。2.中期(9～16周):此期實驗組動物開始出現(xiàn)死亡,死亡動物多伴有腹水及出血。肝臟淤血較前加重,少數(shù)動物出現(xiàn)肝萎縮,肝葉間粘連,肝緣變鈍。鏡檢見肝細胞變性壞死較前加重,部分動物肝內(nèi)見新生血管形成,肝內(nèi)膽管除上述早期病變加重外,還可見下列病變:(1)膽管上皮杯狀細胞化生(11/20);(2)膽管上皮乳頭狀增生(15/20);(3)膽管纖維化(8/20)。上述病變多發(fā)生于大膽管,上述3種病變在同一病變膽管可同時出現(xiàn)。(4)不典型增生(4/20):多發(fā)生在乳頭狀增生的基礎(chǔ)上,上皮細胞呈多層排列,極向消失,核大,深染,核漿比例失調(diào)。在此階段后期已有少數(shù)動物出現(xiàn)肝膽管腺瘤(5/20)及ICC(4/20)(圖3,4)。3.晚期(17～24周):此期動物死亡明顯增多,肝臟多表現(xiàn)為萎縮,少數(shù)動物肝臟淤膽。肝葉間界限消失,整個肝臟融合為一體。膽囊表現(xiàn)為擴張或萎縮,可伴有膽囊結(jié)石。發(fā)生腫瘤的動物肝臟表面見大小不等的白色結(jié)節(jié),最大者直徑達0.7cm。鏡檢:肝內(nèi)膽管的各種增生性病變多見,膽管腺瘤(12/20)及ICC(10/20)常見。膽管腺瘤:常為多發(fā),由腺管樣排列的膽管上皮細胞構(gòu)成,多呈單層排列,腺管大小不一,形狀不規(guī)則,間質(zhì)成分較少,少數(shù)可見向腺癌的移行。ICC:多中心發(fā)生,多為高分化腺癌,中分化腺癌少見(2/14,且均出現(xiàn)于第24周),腺腔大小及形態(tài)極不規(guī)則,癌細胞呈單層或復(fù)層排列,腺管間為多少不等的纖維結(jié)締組織,有時間質(zhì)甚少,使腺體呈背靠背排列。較大腫瘤組織中央可出現(xiàn)壞死。癌灶附近常伴有膽管腺瘤和/或不典型增生。肝內(nèi)可見增生的肝細胞結(jié)節(jié),但未見肝細胞癌發(fā)生。部分動物膽囊、肝外膽管上皮出現(xiàn)增生,但無腫瘤形成。胃、胰腺、肺等器官未見腫瘤發(fā)生及ICC轉(zhuǎn)移病灶(圖5,6)。本動物模型的優(yōu)點Lijinsky等研究證實氨基比林和亞硝酸鈉在小鼠胃內(nèi)生成二甲基亞硝胺(DMN),后者導(dǎo)致了小鼠肝血管肉瘤的發(fā)生。我們以敘利亞地鼠為實驗對象,以相同的誘癌劑和相同的給藥途徑誘發(fā)出了ICC,而未見肝血管腫瘤和肝細胞癌的產(chǎn)生,與Bergman和Wahlin的研究結(jié)果一致。同樣以DMN作為誘癌劑,則可誘發(fā)大鼠的肝細胞癌。造成上述差異的原因是不同種屬的動物對亞硝胺類化合物反應(yīng)的差別很大,其中包括產(chǎn)生腫瘤的靶器官和腫瘤的組織類型。本實驗結(jié)果表明,隨著實驗時間的推移,肝內(nèi)膽管癌程度逐漸加重,并且在ICC的病灶周圍常可見各種增生性病變及腺瘤,說明本實驗所誘發(fā)的敘利亞地鼠ICC與人類ICC相似,本模型可模擬人類ICC發(fā)生發(fā)展的基本過程。我們認(rèn)為本動物模型具有以下優(yōu)點:(1)腫瘤發(fā)生率較高,組織學(xué)類型單一;(2