噬菌體展示技術與外源蛋白質(zhì)的研究進展

近年來，pdt更新技術廣泛應用于免疫、多媒體、蛋白質(zhì)和酶的制備，以及對蛋白質(zhì)和酶的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)、蛋白質(zhì)和酶的相互作用、蛋白質(zhì)結構和功能的解釋等方面。它具有簡單、有效、易于控制的特點，為蛋白質(zhì)研究的獨特優(yōu)勢和巨大應用潛力提供了辯護。本文概括介紹了不同的噬菌體展示系統(tǒng)及其在蛋白質(zhì)研究中的應用。1.噬菌體顯示技術作為一項已廣泛運用的技術,噬菌體展示是一種將外源肽或蛋白質(zhì)與特定噬菌體衣殼蛋白融合并展示于噬菌體表面的技術。它將外源基因插入到噬菌體展示載體的信號肽基因和衣殼蛋白編碼基因之間,從而使外源基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)與外殼蛋白以融合蛋白質(zhì)形式展示在噬菌體表面,被展示的外源肽或蛋白質(zhì)可保持相對獨立的空間結構和生物活性。與其他表達系統(tǒng)相比,噬菌體展示技術可將基因型和表型、分子結合活性與噬菌體的可擴增性結合在一起,實現(xiàn)了基因型和表型的轉(zhuǎn)換,是一種高效的篩選系統(tǒng)。噬菌體顯示技術主要包括三方面內(nèi)容(圖1):一是通過DNA重組的方法插入外源基因,形成的融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面,同時保持外源蛋白的天然構象,不影響噬菌體的生活周期,也能被相應的抗體或受體所識別;二是篩選目的噬菌體,利用固定于固相支持物的靶分子,采用適當?shù)奶韵捶椒?洗去非特異結合的噬菌體,篩選出融合噬菌體;三是外源多肽或蛋白質(zhì)表達在噬菌體的表面,而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導出來。噬菌體親和篩選的方法包括直接法和間接法,前者是將蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到固相支持物上,加入噬菌體肽庫,與固相支持物溫育,洗去未結合的噬菌體,既獲得親和噬菌體,其中固相支持物有很多,包括樹脂、各種尺寸的珠子、96孔板甚至可用于分析的生物傳感芯片;后者是將生物素標記的蛋白質(zhì)分子與文庫噬菌體溫育后鋪在結合有鏈親和素的平皿上,洗去未結合的噬菌體,保留結合狀態(tài)的噬菌體,再洗脫結合的噬菌體,用這部分噬菌體感染細菌,擴增噬菌體,開始新一輪的篩選,通過吸附、洗脫、擴增的重復過程,就能選擇性地富集并特異性擴增結合這種蛋白質(zhì)或DNA分子的噬菌體。篩選出的噬菌體的結合特性可以通過基因測序,分析各個克隆間編碼短肽的一致序列,以確證篩選的特異性。最后,可研究其氨基酸短肽的親和特性并推測可能配體的生物學活性和結合或游離狀態(tài)的結構特點。2.噬菌體的選擇目前,用于構建噬菌體展示系統(tǒng)的載體主要有絲狀噬菌體、λ噬菌體、T4噬菌體和T7噬菌體,且各系統(tǒng)各具優(yōu)缺點,選用適合的噬菌體展示系統(tǒng)對研究具有重要意義(表1)。2.1iii蛋白的融合絲狀噬菌體屬于單鏈環(huán)狀DNA病毒,編碼10種蛋白質(zhì),其中與噬菌體展示有關的是pIII和pVIII衣殼蛋白。pIII蛋白位于噬菌體顆粒的一端,有3~5個拷貝,可在N端、近N端或N端與C端的柔性連接區(qū)融合外源肽或蛋白質(zhì),并且對展示的外源多肽或蛋白質(zhì)的大小無嚴格限制。VIII蛋白位于噬菌體顆粒的兩側,一般在N端或近N端融合外源序列,與pVIII基因融合時,每個病毒粒子約有2700個拷貝,含有pVIII的融合蛋白能夠提供多價展示,從而根據(jù)親和力進行目的基因的篩選。2.2外源蛋白裝復λ噬菌體展示系統(tǒng)是將外源肽或蛋白質(zhì)與λ噬菌體的主要尾部蛋白(thetailprotein,gpV)或λ噬菌體頭部組裝的必需蛋白(theheaddecorationprotein,gpD)蛋白融合而被展示的。在λ噬菌體頭部組裝過程中,當DNA進入頭部以后,頭部組裝蛋白gpD附著于衣殼外側,將噬菌體頭部固定。gpD是λ噬菌體頭部組裝必需的蛋白質(zhì),也稱裝飾蛋白。當噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時,它可以在缺少gpD的情況下完成組裝,故gpD可作為外源序列融合的載體,這種展示一般為N端展示。gpD展示的體外組裝途徑是將D融合蛋白結合到λD-噬菌體表面。體內(nèi)組裝途徑是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的E.coli菌株中,從而彌補溶源菌所缺的gpD,并通過熱誘導組裝,或利用噬菌體P1的Cre-LoxP定點重組系統(tǒng)將外源基因整合到λ噬菌體基因組中。此外,λ噬菌體的主要尾部蛋白gpV也可以插入外源序列。gpV有兩個折疊區(qū),C端的折疊區(qū)是病毒的非功能區(qū),可供外源序列插入或替換。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個分子/噬菌體,這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了噬菌體的尾部裝配。λ噬菌體是在宿主細胞內(nèi)完成裝配的,無需將外源肽或蛋白分泌到細菌胞膜外,可展示有活性的大分子蛋白質(zhì)(100kDa以上蛋白質(zhì))及對宿主細胞有毒性的蛋白質(zhì),適用范圍極廣。目前,已通過構建λ噬菌體的完整基因組文庫發(fā)現(xiàn)了新的肺炎支原體抗原,這種支原體常導致兒童和青少年非典型肺炎。2.3外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)酶融合T4噬菌體基因組DNA為雙鏈線形,呈環(huán)狀排列,并且噬菌體衣殼的外表面包被著2種非必需外殼蛋白:SOC(smalloutercapsidprotein)和HOC(highlyantigenicoutercapsidprotein)。T4噬菌體表面展示是將外源多肽或蛋白質(zhì)分別與SOC位點的C末端和HOC位點的N末端融合而展示于T4噬菌體表面。SOC位點展示是通過一個重組載體,將融合有外源序列的SOC融合基因同源整合入缺失SOC的T4基因組中,選擇恢復溶菌酶生長不依賴性的噬菌體,即可將外源肽或蛋白質(zhì)展示于噬菌體表面。HOC位點展示則通過體外包裝實現(xiàn),將目的基因連接于hoc基因的C端,構建hoc融合基因表達載體,并在IPTG的誘導下表達HOC融合蛋白。在與HOC蛋白缺失的T4噬菌體突變株共感染時,將HOC融合蛋白包裝到T4噬菌體衣殼表面的HOC位點,實現(xiàn)外源蛋白質(zhì)在T4噬菌體的HOC位點的展示。若將SOC與外源蛋白質(zhì)的融合基因整合入噬菌體基因組中,再取已經(jīng)整合了外源基因的噬菌體按HOC位點展示的方法進行HOC位點體外包裝,就可實現(xiàn)SOC、HOC雙位點的同時展示。此外,T4噬菌體的扁長型二十面體衣殼,使其系統(tǒng)容量大,可以體外組裝,拷貝數(shù)高。2.4噬菌體展示系統(tǒng)T7噬菌體基因組為線性雙鏈DNA,其衣殼蛋白通常有兩種形式,即10A(344個氨基酸殘基)和10B(397個氨基酸殘基),10B衣殼蛋白區(qū)存在于噬菌體表面,所以被用作噬菌體展示。T7噬菌體展示系統(tǒng)可以高拷貝量展示50個氨基酸的多肽,以低拷貝量(0.1~1/噬菌體)或以中拷貝量(5~15/噬菌體)展示1200個氨基酸殘基的多肽或蛋白質(zhì),分別與相應親和力區(qū)域結合,其實用性較強。并且T7噬菌體展示系統(tǒng)是通過C端融合表達蛋白,插入片段被克隆到T7噬菌體載體基因10B的C端。因此,即使插入片段內(nèi)含有終止密碼子,同樣也可以被其表達和展示。T7噬菌體作為一種高效的展示工具,已廣泛用于蛋白質(zhì)的研究中,近來更是發(fā)現(xiàn)T7噬菌體展示工具可通過單循環(huán)高效的親和選擇結合蛋白或特異肽。3.中融合酶的發(fā)現(xiàn)技術在蛋白質(zhì)研究中的應用3.1蛋白質(zhì)修飾噬菌體隨機展示文庫技術被廣泛應用于研究蛋白質(zhì)與其他配基的相互作用。完整的蛋白質(zhì)或結構域與噬菌體蛋白形成融合噬菌體,為研究結構與功能的相互關系提供了一個非常有效的工具。并且,展示大的多肽片段不是受限于插入序列的大小,而是依賴于這些蛋白質(zhì)是否具有通過宿主菌(E.coli)內(nèi)蛋白質(zhì)修飾或提高蛋白質(zhì)的結合能力或催化能力。近來,已經(jīng)從展示文庫中獲得許多具有價值的蛋白質(zhì),如通過噬菌體展示對T細胞受體可變區(qū)域結構特性的研究,此可變區(qū)有利于加強區(qū)域穩(wěn)定性和VαVβ等單鏈片段的表達。谷氨酸結合肽1(QBP1)也在噬菌體表面以生物活性方式表達,發(fā)現(xiàn)QBP1可結合致病的谷氨酸蛋白,從而抑制推遲神經(jīng)組織退化等。研究這些蛋白質(zhì)的功能對人類疾病的治療和藥物開發(fā)有著重要的意義。當?shù)鞍踪|(zhì)或功能亞基被表達于噬菌體表面,插入蛋白質(zhì)的天然的四級結構就提供了一個具有廣泛突變位點的用來限制折疊的框架。如許多真核生物的轉(zhuǎn)錄因子具有鋅指結構,每個部位與DNA靶位點上的3個堿基對作用,其中沒有固定的規(guī)律。在鋅指與DNA作用的方面,通過鋅指做框架,能夠篩選出與新的寡聚核苷酸相互作用的嵌合噬菌體。3.3噬菌體展示技術蛋白質(zhì)的相互作用是生命過程中所不可缺少的,噬菌體展示的多肽文庫是由特定長度的隨機短肽序列組成。用靶蛋白質(zhì)(如受體、抗體等)對該隨機文庫進行親和淘篩,就可以獲得與之結合的短肽序列。對所得序列測定分析,并合成相應的短肽,從而可以來研究兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用。噬菌體展示技術和蛋白質(zhì)水解作用相結合可篩選穩(wěn)定折疊的蛋白質(zhì),這種方法不依賴蛋白的特異性,理論上適用于任何蛋白質(zhì)。應用此種方法生產(chǎn)的高適溫性蛋白(hyperthermophilicprotein),可使多肽片段形成新的折疊結構域或使部分折疊區(qū)完全折疊。利用這種方法已經(jīng)成功鑒定出多個重要大分子,如生長激素受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體和TNF-α受體的激動劑和頡頏劑等。近年來,噬菌體展示技術已經(jīng)用于高效的探測蛋白質(zhì)的相互作用,尤其是T7噬菌體展示系統(tǒng)的運用,其目的是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的小分子抑制劑,從而用于各種疾病的治療。這些研究表明,噬菌體展示技術可用于闡明受體的分子結構,以位點特異的方式確認其生物活性所需要的關鍵區(qū)域。3.4基于序列的點分子身份證構建的基因序列可利用靶蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)隨機展示文庫中篩選一個與其相互作用的蛋白質(zhì),并定點突變,以實現(xiàn)對其特定位點和功能域進行定向選擇。因此定點突變結合噬菌體展示技術成了篩選蛋白功能域的一個有力工具。蛋白質(zhì)的定向改造指的是用盒式突變、錯誤傾向PCR等方法來突變蛋白質(zhì)或結構域的某一特定編碼序列,產(chǎn)生蛋白質(zhì)或結構域的突變文庫呈現(xiàn)在噬菌體表面,通過親和篩選獲得所需的已定向改變的噬菌體克隆,其一級結構可以從DNA序列中推導出來,可用來篩選具有更強受體結合能力的細胞因子、新的酶抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子的DNA結合新位點、新的細胞因子拮抗劑、新型酶和增強生物學活性的蛋白質(zhì)等。利用錯配PCR等結合定點突變技術,構建了鋅指DNA結合蛋白的噬菌體展示文庫,研究有關氨基酸殘基序列與DNA結合位點之間的識別規(guī)則,可以通過設計特異的多肽去控制基因的表達,如近期,對腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)的研究,已知TNF是抗炎和抗癌藥物的重要靶標,在發(fā)病過程中起到重要的調(diào)控作用,通過對TNF的選擇性突變,為TNF受體功能研究提供了有力工具。蛋白質(zhì)的定向設計可根據(jù)人類的需要而廣泛運用,對于功能蛋白質(zhì)的實際應用有著重要的現(xiàn)實意義。3.5病毒前體在細胞生物學和中和性單抗中的應用從多肽庫中可分離到與天然激素相似的、與受體結合的高親和力的多肽,利用完整細胞從多肽庫中找到受體的高選擇性配體,如利用噬菌體展示技術研究發(fā)現(xiàn),人白細胞介素-4受體(IL-4)作為靶標是對藥物篩選,及動脈粥樣硬化分子成像的重要工具。用完整的Puumala漢坦病毒淘選一個CX7C多肽庫,并利用該病毒的中和性單抗進行競爭性洗脫,所分離的一個多肽能與漢坦病毒結合,并使該病毒不能結合或感染細胞。這個多肽和單抗在體外以相同的有效濃度中和病毒。Shukla等建立了一種快速篩選β-內(nèi)酰氨酶配體的方法,篩選出的β-內(nèi)酰氨酶配體作為一種頭孢菌素類藥物前體在病毒導向的酶解藥物前體療法治療腫瘤方面具有較大潛力。用這種類似方法可以得到更多用于腫瘤酶解藥物前體療法治療的藥物分子。Jager等利用噬菌體展示技術篩選出了非白血性白血病相關的配體。除了配體的篩選外,噬菌體展示亦可高效篩選出各種受體,并有效地研究其功能。如He等運用優(yōu)化的T7cDNA噬菌體展示文庫對多個受體的天然產(chǎn)物同時進行驗證,并用環(huán)孢霉素作為親和探針進行靶蛋白的篩選,從而為多個受體天然產(chǎn)物的研究奠定了重要基礎。利用噬菌體展示技術不僅可以發(fā)現(xiàn)新的受體和配體,對受體與配體間相互作用的研究也起到重要作用,為相關疾病的基因治療和藥物設計奠定了重要基礎。3.6fabg抑制劑Kristan等通過噬菌體展示文庫結合并篩選出β-酮脂酰-ACP還原酶(FabG)的抑制劑。已知該酶是原核生物脂肪酸生物合成代謝中高度保守和廣泛存在的酶,因此,β-酮脂酰-ACP還原酶可作為新型抗菌劑開發(fā)的靶標。噬菌體展示技術為其抑制劑的研究提供了有力平臺,如許多從大腸桿菌中篩選出的反式肉桂酸的衍生物就被作為FabG的抑制劑,用于抑制其活性。Dennis等從噬菌體肽庫中篩選到能非競爭地抑制凝血因子(FactorVIIa,FVIIa)活性的肽段,該肽段有很高的特異性和很強的親和性,對其結構的分析表明,此肽段結合在已知活性位點之外的區(qū)域,肽段與此位點結合后通過別構效應來抑制FVIIa的活性。利用噬菌體展示技術,以黑曲霉葡萄糖淀粉酶為靶分子,從噬菌體多肽庫中經(jīng)過3輪生物淘選篩選得到3個特異性結合的噬菌體克隆,化學合成了環(huán)狀多肽,其序列對應結合力最強的一個克隆為GB1的N端10個氨基酸殘基,該多肽可以競爭性地抑制黑曲霉葡萄糖淀粉酶以及大鼠小腸的α-葡萄糖苷酶。目前,已針對乙酰膽堿酯酶、海藻糖酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰CoA羧化酶和谷氨酰胺合成酶等靶標酶,開發(fā)和研制了一系列高效的殺蟲劑和除草劑。噬菌體技術的運用,對各靶標酶抑制劑的篩選奠定了重要基礎,對新型農(nóng)藥的開發(fā)具起到巨大的作用。3.7最佳模型的確定—研究細胞信號轉(zhuǎn)導噬菌體展示技術還被用于信號轉(zhuǎn)導時分子的識別。鈣調(diào)蛋白(CaM)在胞內(nèi)信號傳導中作用非常重要,可以和許多靶蛋白或酶結合并調(diào)節(jié)其功能。實驗表明使用含有CaM抑制劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK細胞時,將影響周期蛋白依賴性蛋白酶(cdk4、cdk2)的活性。為了進一步研究其功能,運用CaM親和層析篩選噬菌體展示肽庫,獲得新的CaM結合蛋白,發(fā)現(xiàn)核內(nèi)核糖體蛋白與CaM相關聯(lián),說明CaM與對核糖體的裝配和功能起到調(diào)節(jié)作用,CaM可能調(diào)節(jié)核的裝配和功能。此外,可選用依賴cAMP的蛋白激酶(CAPK)做研究模型,用標記的ATP和CAPK篩選隨機5肽庫和7肽庫可得到CAPK的底物功能片段。3.8噬菌體展示技術抗原表位分析技術是以單克隆抗體(mcAb)作為固相篩選分子,加入噬菌體隨機多肽庫,使其與單抗充分反應,經(jīng)數(shù)輪“吸附-洗脫-擴增”的篩選過程,且每次增加篩選強度,用最后一次淘洗的噬菌體感染宿主菌,隨機挑選克隆,經(jīng)噬菌體ELISA鑒定并進行交叉反應實驗和競爭抑制性實驗,對所選的陽性克隆通過DNA序列分析,就可以知道該噬菌體所攜帶的外源肽序列,從而得知該單抗針對的特異性抗原表位。如運用噬菌體展示技術對人類嗜T淋巴細胞病毒I(TlymphotropicvirustypeI,HTLV-I)相關脊髓病腦脊液中免疫球蛋白G(immunoglobulinG,IgG)的抗原表位分析。該技術在揭示抗原分子的結構和功能,抗原-抗體反應機制方面具有重要意義,亦為研制診斷試劑,設計多肽疫苗和篩選藥物等研究提供依據(jù)。此外,研究發(fā)現(xiàn)噬菌體展示模擬表位比天然表位誘發(fā)的抗體活性高3倍,這表明此模擬表位噬菌體可以作為腫瘤疫苗用于預防和治療腫瘤。4.噬菌體展示技術的局限性綜上所述,噬菌體展示技術在蛋白質(zhì)應用研究方面顯示出極大的實用性,因其能夠有效地實現(xiàn)基因型和表現(xiàn)型的體外轉(zhuǎn)換,使研究者可以在基因分子克隆的基礎上,較準確地實現(xiàn)蛋白質(zhì)構象的體外控制,從而可獲得具有良好生物活性的表達產(chǎn)物。尤其是T7噬菌體展示系統(tǒng),由于其特有的優(yōu)點,已成為目前運用最為廣泛的噬菌體展示系統(tǒng)。但是這項技術仍存在著自身的局限性,主要表現(xiàn)在以下幾方面:(1)受大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率的的限