甲基強的松龍對急性脊髓損傷后下丘腦室旁核神經元fos和一氧化氮合酶表達的影響

不僅導致局部神經組織的退行性壞死、穿孔形成和骨葬，還可能導致大腦和血管活動的中樞性債權人的退行性壞死、后續(xù)損傷和心血管功能障礙。下丘腦室旁核(hypothalamicparaventricularnucleus,PVN)是調節(jié)血管活動的神經內分泌中樞核團之一。PVN內部分神經元發(fā)出下行纖維向脊髓投射形成室旁脊髓束,因而SCI后PVN也是其中易受影響的神經核團。甲基強的松龍(methylprednisolone,MP)是目前經研究證實治療急性SCI、改善神經功能的有效藥物。因此研究急性SCI后心血管活動中樞核團內神經元的反應變化及其MP治療對其影響,對于防治SCI所致的心血管并發(fā)癥有重要意義。本研究通過建立大鼠脊髓橫斷模型,給予大劑量注射MP治療1天、1周和4周后,應用組織化學和免疫組織化學的方法觀察腦組織中PVN內FOS/NOS表達情況,以探討MP對SCI后PVN神經元的保護作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1分組、治療方法實驗選用200～300gSD大鼠36只(南京醫(yī)科大學動物中心提供),雌雄不限,隨機分3大組(損傷后治療1天、1周和4周),各大組設對照、損傷和治療組,每組4只。1.1.2動物fos硝基四氮唑藍(NBT,美國Sigma公司);β-NADPH(美國Sigma公司);兔抗大鼠FOS(美國Sigma公司);含生物素標記的羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。1.2方法1.2.1治療組和治療方法應用橫斷法制作大鼠SCI模型。腹腔注射2%苯巴比妥(50mg/kg),麻醉平穩(wěn)后,取俯臥位,通過兩側胸斜方肌腱連接點來確定13肋,約對T12～13,根據棘突順序確定T4。碘伏消毒,分別以T4為中心切開皮膚,鈍性分離軟組織、肌層,并用小牽開器撐開,顯露出T3～5的棘突和椎板。用咬骨鉗咬斷棘突和椎板,充分暴露脊髓。小心剪開硬脊膜和蛛網膜,用顯微眼科剪剪斷脊髓,并用顯微手術刀片在切口處反復切割,以確保脊髓完全切斷。分層縫合肌肉、皮膚。對照組:暴露但不切斷脊髓,其他步驟同手術組。治療1天組:對照組和損傷組兩組靜脈注射生理鹽水(30mg/kg);治療組術后立即靜脈注射MP(30mg/kg)。與此相對應,治療組給予每日1次靜脈注射MP(30mg/kg),分別持續(xù)1天、1周和4周;損傷組給予每日靜脈注射等量生理鹽水,分別持續(xù)1天、1周和4周。1.2.2冷切片染色實驗各組分別于術后24h、1周、4周,常規(guī)左心室灌注,取含下丘腦PVN的組織,后固定,置入含30%蔗糖的0.01mol/LPBS,4℃過夜。Leica恒冷箱冰凍切片機連續(xù)切片,片厚30μm,隔5張取2張,分2套收集于0.01mol/LPBS內。1套行尼氏染色進行核團定位;另1套行NADPH-d組織化學及FOS免疫組織化學染色。1.2.3fos-4pbs法反應流程同本實驗既往報道。切片在反應液中37℃避光孵育1h,反應液組成:0.1mol/LPBS(pH8.0),含0.3%TritonX-100,0.6g/LNBT,0.5g/Lβ-NADPH。反應后經0.01mol/LPBS充分洗滌后,置入含兔抗大鼠FOS(1∶3000)0.01mol/L,pH7.4PBS中37℃孵育2h;漂洗后,加入含生物素標記的羊抗兔IgG液(1∶100),37℃孵育30min;反復漂洗后,行ABC法顯色,0.01mol/LPBS終止反應。貼片、風干、脫水、透明、封片。另用1只正常大鼠,灌注后取腦,取含PVN的組織進行切片,行免疫組化?？瞻讓φ諏嶒炗肞BS代替一抗,抗體交叉實驗先加二抗后加一抗。1.2.4免疫組化和nadph-d對大鼠fos表達的影響根據Paxino和Watson大鼠腦圖譜對尼氏染色切片上的PVN進行定位,以確定該核團的主部。用Leica圖像分析系統(tǒng)對相應的FOS免疫組化和NADPH-d組織化學染色切片進行顯微攝像;并計數核團的主部FOS陽性細胞和NOS陽性神經元數目。每只大鼠統(tǒng)計4張切片,數據結果用SPSS軟件進行統(tǒng)計學處理。細胞計數與統(tǒng)計學分析均采取雙盲法。2結果2.1mp治療組fos表達情況FOS陽性細胞為細胞核著色,呈棕黃色。空白對照實驗與抗體交叉實驗,切片未見FOS陽性標記細胞。對照組兩側PVN的大、小細胞內部均可見FOS陽性細胞,呈中等密度分布。同對照組相比,脊髓損傷組FOS陽性細胞數量顯著增加(P<0.01),FOS陽性細胞在內側小細胞亞核呈高密度分布,免疫反應呈強陽性,細胞核深染。MP治療組24hPVN內FOS表達較損傷組無顯著下降(P>0.05)。MP治療1周、4周PVN內FOS表達較損傷組顯著下降(P<0.01,圖1A,圖2)。2.2mp治療對pvn表達的影響在3組實驗動物PVN內均可見胞漿呈紫藍色的NOS陽性神經元,大多數集中在PVN的大細胞部,而小細胞部僅有少量NOS陽性神經元。MP治療組24hPVN內NOS表達較損傷組無顯著下降(P>0.05)。MP治療1周、4周PVN內NOS表達較損傷組顯著下降(P<0.01,圖1B,圖2)。2.3fos雙標函數vsn3偶爾，兩組均發(fā)現陽性fos算法，無統(tǒng)計學意義p0.053mp對pvn神經元的保護作用c-fos是一種原癌基因,在包括神經元在內的絕大多數正常細胞中均有低水平的表達,對細胞的生長、分化和功能活動至關重要。同時c-fos也屬于一種即刻早期基因,中樞神經細胞受到特異性刺激后,神經細胞內c-fos將快速表達,FOS蛋白大量合成并迅速堆積于胞核。通過它們的表達和整合信息、作用于目的基因改變其轉錄水平,發(fā)揮細胞核內第二信使的作用。少量FOS參與神經細胞的生長分化和損傷修復的調節(jié);而大量FOS表達對神經元有損傷作用。同時,在正常情況下,PVN小細胞部內少量NOS陽性神經元,可催化左旋精氨酸生成NO。在傷害性刺激等狀態(tài)下,NOSmRNA表達增強,由NOS產生大量NO對神經細胞產生毒性作用。本實驗選擇FOS免疫組織化學技術和NADPH-d組織化學技術,觀察MP治療脊髓橫斷后PVN內FOS和NOS表達。免疫組織化學和圖像分析結果表明脊髓橫斷后的大鼠PVN中FOS和NOS明顯表達增加,這可能表明受到傷害性刺激可引起中樞繼發(fā)性損傷,本實驗觀測到這種損傷在損傷后第1天至第4周均存在。同時,本實驗觀察到急性SCI大鼠經MP治療后,24hPVN內FOS、NOS表達較損傷組無顯著下降(P>0.05)。治療1周、4周PVN內FOS、NOS表達較損傷組顯著下降(P>0.01)。下調FOS和NOS表達,提示MP對SCI后PVN神經元具有保護作用。MP對神經系統(tǒng)作用的主要原理