SDS－PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量【目的要求】學(xué)習(xí)SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運(yùn)用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定?！緦?shí)驗(yàn)原理】電泳帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。PAGE

聚丙烯酰胺凝膠（PAG）是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)和引發(fā)劑過(guò)硫酸銨(AP)的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠作為支持介質(zhì)的電泳稱為PAGE。PAGE具有電泳和分子篩的雙重作用。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CHC=O

NH

CH2

NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m

PAG機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，改變

Acr濃度或Acr與Bis的比例可以得到不同孔徑的凝膠。

PAGE分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值與凝膠中的相同.帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。SDS

是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)?！維DS基本原理】

強(qiáng)還原劑巰基乙醇可以斷開(kāi)二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS

復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)。有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，它們?cè)?/p>

SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測(cè)定的只是亞基或單條肽鏈的MW。將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS

中的電泳遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測(cè)得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,000～165,000之間時(shí)，