中華蜜蜂與意大利蜜蜂營養(yǎng)雜交的遺傳多樣性分析

隨機擴增多態(tài)dna（randomark微軟dna）（rapd）技術是由兩個研究團隊同時開發(fā)的一種用于在dna分子水平上檢測大大提高多態(tài)性的技術。rad技術在蜜蜂研究中得到了成功的應用。人們對同一蜂種不同蜜蜂品種之間的營養(yǎng)雜交研究較早,如Ruttner、Smaragdova、Rinderer等系統(tǒng)研究了西方蜜蜂不同品種之間營養(yǎng)雜交特性,并發(fā)現(xiàn):當甲蜜蜂品種的工蜂哺育乙蜜蜂品種的幼蟲后,這些幼蟲發(fā)育成的工蜂則不同程度具有甲蜜蜂品種的形態(tài)和體色特性。國內許多養(yǎng)蜂工作者利用我國同時具有大量飼養(yǎng)東方蜜蜂和西方蜜蜂的優(yōu)勢,先后進行過中華蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius)(簡稱中蜂)與意大利蜜蜂(ApismelliferaligusticaSpinola)(簡稱意蜂)之間的營養(yǎng)雜交實驗,也發(fā)現(xiàn)把中蜂的幼蟲放入意蜂群中飼喂后,中蜂腹部出現(xiàn)了意蜂特有的2~3條淺黃環(huán);同理當把意蜂的幼蟲放入中蜂群中飼喂后,結果意蜂也具有中蜂的某些體色特性。譚墾等也研究了東方蜜蜂和西方蜜蜂互相交換子脾進行哺育的行為。至今還沒有人運用RAPD技術在分子水平上檢測中蜂與意蜂營養(yǎng)雜交工蜂的特性,鑒于此,我們開展了本項研究,結果報道如下。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1實驗蜜蜂的來源實驗蜂群為江西農業(yè)大學動物科技學院飼養(yǎng)的中蜂與意蜂。1.1.2dna標記s:1.2蛋白酶K、RNA酶A、平衡酚、Taq酶、dNTPs,DL2000+15000的DNAMark,Ringerbuffer、Wilsonbuffer、蛋白酶K、RNA酶A、乙酸鈉、TE緩沖液等。1.2實驗方法1.2.1蜂群的培養(yǎng)①親本蜂群的組織:選擇顏色較純的中蜂與意蜂各3群,分別將它們合并成群勢很強的中蜂群A和意蜂群B。整個實驗過程對蜂群進行獎勵飼喂.②中蜂與意蜂營養(yǎng)雜交:在蜂群A中加入育王框,等工蜂清理12h后,在王臺中移入A群中的小幼蟲。24h后,將育王框取出,輕輕取出王臺中小幼蟲,保留王臺中的蜂王漿,馬上移入蜂群B中1日齡小幼蟲,把育王框插入蜂群A中哺育12~24h,抽出育王框,輕輕抖落育王框上的蜜蜂,并將育王框插入蜂群B中繼續(xù)哺育,然后定期人工飼喂中蜂的新鮮王漿。王臺封蓋后第4d,選擇外形大的王臺安裝在框式貯王籠中,并把框式貯王籠放入蜂群B中。待處女蜂王成熟時,取意蜂雄蜂的精液,對處女蜂王進行人工受精,放入已經組織好的小群中。在巢門口安上隔王柵,防止蜂王出巢自然交尾,蜂王產卵培育后代即為營養(yǎng)雜交意蜂子1代。用同樣方法,可培育營養(yǎng)雜交意蜂子2代和子3代。同理,在蜂群B中加入育王框,等工蜂清理12h后,在王臺中移入B群中的小幼蟲。24h后,將育王框取出,輕輕取出王臺中小幼蟲,保留王臺中的蜂王漿,馬上移入蜂群A中1日齡幼蟲,把育王框插入蜂群B中哺育12~24h,抽出育王框,輕輕抖落育王框上的蜜蜂,并將育王框插入蜂群A繼續(xù)哺育。然后定期人工飼喂意蜂的新鮮王漿。在王臺封蓋后第4d,選擇外形大王臺分別誘入已組織好的中蜂交尾群中,處女蜂進行自然交尾,蜂王產卵培育的后代即為營養(yǎng)雜交中蜂子1代。用同樣的方法,可培育營養(yǎng)雜交中蜂子2代。③蜜蜂樣品的準備:在以上各蜂群中隨機采集活體幼齡工蜂,并立即浸入75%的酒精中密閉待用。1.2.2提取dna的制備取工蜂胸部肌肉,置于1.5mL離心管中,用眼科手術剪將其剪碎。加入560μLDNA抽提液,再加入RNA酶A(10mg/mL)4μL,置于恒溫箱中37℃消化2h。取出,加入蛋白酶K(10mg/μL),充分混勻,用封口膜將離心管蓋封好,55℃消化12~24h。加入等體積的苯酚,緩慢顛倒離心管10min使溶液的兩相充分混勻,以12000r/min離心12min,將上清液移至另一干凈離心管。加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1),充分混勻,離心,取上清液。加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1),重復上述抽提步驟。向最后獲得的上清液中加入無水乙醇800μL和3mol/LNaAc45μL。以12000r/min離心10min,小心倒去液體。用75%乙醇洗滌2次。用瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計檢測提取的DNA濃度和純度。將DNA自然晾干后溶入適量TE中,-20℃保存待用。1.2.3紫外分光光度法檢測脂糖凝膠od瓊脂糖凝膠電泳檢測:取10μL待測DNA溶液和2μL加樣緩沖液(LoadingBuffer)混勻,上樣于1%的瓊脂糖凝膠,100V電泳1h,待樣品跑到4/5處時,把膠取下放于10%的EB中染色10min,紫外燈下觀察電泳結果并拍照保存。結果見圖1:分光光度法檢測:取6μL待測DNA溶液稀釋500倍至3mL,分別在紫外分光光度計260nm和280nm處測定其OD值。DNA濃度(μg/mL)=OD260×稀釋倍數(shù)×50DNA純度=OD260/OD2801.2.4最佳pcr條件的確定所用的10對RAPD隨機引物,由上海生物工程有限公司合成,序列如下:AW20424:GAAACGGGTG;AW20425:ACGGATCCTG;AW20426:TGAGCCTCAC;AW20427:CACCCGGATG;AW20428:GGTCGGAGAA;AW20429:TGGTCGCAGA;AW20430:TGTTCCACGG;AW20431:CCCTACCGAC;AW20432:TTTGCCCGGT;W16754:CGGCCCGGGT.最佳PCR反應條件的建立:各組成份的優(yōu)化結果見表1。PCR循環(huán)參數(shù)如下:94℃預變性5min;94℃變性60s;36℃退火60s;72℃延伸120s;72℃延伸10min;循環(huán)40次.PCR產物電泳:取10μLPCR擴增產物和2μL加樣緩沖液(LoadingBuffer)混勻,上樣于1%的瓊脂糖凝膠,100V電泳2h,待樣品跑到4/5處時,將膠取下放于10%的EB中染色10min,紫外透射臺上觀察擴增結果,在全自動數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)上拍照。1.2.5建立數(shù)據庫的建立根據蜜蜂DNA的RAPD標記檢測結果,選取清晰可辨的多態(tài)譜帶用于數(shù)據統(tǒng)計分析。有帶的記為1,無帶的記為0,建立數(shù)據庫。利用Excel,按公式GS=2a/(2a+b+c),其中a為2個個體都有的多態(tài)條帶數(shù)目,b為X個體特有條帶數(shù),c為Y個體特有條帶數(shù),計算蜜蜂個體間的遺傳相似系數(shù)。2結果2.1提取的dnaDNA的提取質量往往是決定RAPD分析成功與否的關鍵。電泳結果表明,所提取的基因組DNA主帶清晰、無降解(圖1)。2.2血緣關系的遺傳相似性系數(shù)用以上10對隨機引物對基因組DNA進行擴增,然后從中篩選出了3對能把所有蜂群都擴增出清晰條帶的引物(圖2)。根據圖2計算出各蜂群之間的遺傳相似系數(shù)(表2)。從表2可以看出,親本中蜂與親本意蜂之間的遺傳相似系數(shù)為0.3723。親本意蜂與營養(yǎng)雜交意蜂子1代、子2代和子3代之間的遺傳相似系數(shù)分別為0.5278、0.5397和0.5278;親本中蜂與營養(yǎng)雜交意蜂子1代、子2代和子3代之間的遺傳相似系數(shù)都是0.4141,這比親本中蜂與親本意蜂之間的(0.3723)增加了0.0418;親本中蜂、親本意蜂與雜交中蜂子1代之間的遺傳相似系數(shù)分別為0.6667和0.3833,這一現(xiàn)象也符合以上規(guī)律。另外以上數(shù)據還表明血緣關系的影響大于營養(yǎng)雜交。從圖2可以看出:有些條帶是親本中蜂所特有的,經過營養(yǎng)雜交之后,在營養(yǎng)雜交子代意蜂中也出現(xiàn)了親本中蜂特有的條帶,例如引物AW20425對親本中蜂進行擴增,在分子量2000bp位置上有明顯的特殊條帶(2泳道),親本意蜂則沒有(1泳道),但經過營養(yǎng)雜交之后,在雜交后代意蜂中也出現(xiàn)了該條帶(3、4、6泳道);同樣有些親本意蜂所特有條帶,經過營養(yǎng)雜交之后,在營養(yǎng)雜交子代中蜂中也出現(xiàn)了,例如W16754對親本意蜂進行擴增,在分子量2000bp與1000bp之間有條明顯的條帶(1泳道),親本中蜂則沒有,但經過雜交后,在雜交后代中蜂上也出現(xiàn)了該條帶(5泳道)。這些說明通過營養(yǎng)雜交后,基因可能發(fā)生了轉移。3營養(yǎng)雜交的代爾經過營養(yǎng)雜交之后,子代與親本之間的遺傳相似系數(shù)降低了不少,并且有朝著向對方蜂種靠攏的趨勢。在實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)