甲基化柚皮素和乙?；制に氐暮铣杉捌淇鼓[瘤活性研究

黃酮類化合物，化學(xué)名稱為5、7、4-三羥基二羥黃酮。廣泛應(yīng)用于薔薇科植物，如櫻桃、梅花和橙色。它具有抗逆性、抗腫瘤形成和生長(zhǎng)、降血糖、抑制血小板聚集和抵制動(dòng)脈硬化等作用。黃酮類化合物的母核結(jié)構(gòu)相似,多數(shù)成分脂溶性和水溶性不甚理想,生物利用度低。通過對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,引入脂溶性或水溶性較強(qiáng)的基團(tuán),可提高其脂溶性或水溶性,從而提高生物利用度。其結(jié)構(gòu)修飾主要包括羥基的烷基化、?；?、磺化、苷化及形成金屬配合物等。1設(shè)備和材料1.1核磁共振譜儀和超凈工作臺(tái)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(德國(guó)Bruker公司生產(chǎn),型號(hào)EsquireLC);核磁共振譜儀(德國(guó)Bruker公司生產(chǎn),型號(hào)AVANCE400M);超凈工作臺(tái)(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司);恒溫CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)BIO-RAD)。1.2mtt細(xì)胞及肝胰腺因子表達(dá)柚皮素由西安小草植物科技有限責(zé)任公司提供,純度≥99%;其余試劑均為分析純;胰蛋白酶(SIGMA);新生牛血清(HYCLONE);人源肝腫瘤細(xì)胞(SMMC-CTT21);MTT(SIGMA);DMSO(SIGMA);RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)。2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果2.1路線1:均為未報(bào)道報(bào)道李鐵軍等對(duì)柚皮素的甲基化和乙?；苌镞M(jìn)行了心血管系統(tǒng)方面的藥理作用研究,但合成路線未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以柚皮素為原料,以K2CO3為縮合劑,碘甲烷為甲基化試劑進(jìn)行甲基化反應(yīng),以乙酸酐為?；噭?硫酸為催化劑進(jìn)行酰化反應(yīng),合成了7,4′-二甲基柚皮素(Ⅱ)和5,7,4′-三乙酰柚皮素(Ⅲ),并進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選,見圖1。2.27無水乙醇結(jié)晶法m.柚皮素2.0g(7.20mmol),丙酮30mL,無水K2CO32.8g(21.60mmol),依次加入100mL三口圓底燒瓶中,40℃,反應(yīng)2h后加入CH3I2.0mL(36.67mmol),反應(yīng)12h(TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程),減壓蒸干,得到黃色泡沫狀物,柱層析氯仿∶甲醇∶乙酸(37∶1∶0.2),得黃色物1.48g,無水乙醇結(jié)晶,得白色針狀結(jié)晶1.10g,收率55.0%。m.p.116℃。IR(KBr)/cm:802.91,828.38,959.86,1375.32,1629.59,2963.62,3396.37;ESI-MSm/z:298[M-1],284[M-CH3-1];1H-NMR(CH3COCH3-d6):2.79(1H,dd,J=16.8Hz,J=12.6Hz,3-H),3.57,(1H,dd,J=16.8Hz,J=3.0Hz,3-H),3.81(3H,s,-OCH3ˉˉˉˉ)?3.83(3H,s,?OCΗ3ˉ)?3.83(3Η,s,-ΟCH3ˉˉˉˉ)?5.52(1HΗ3ˉ)?5.52(1Η,dd,J=12.6Hz,J=3.0Hz,2-H),6.03(1H,d,J=2.4Hz,6-H),6.04(1H,d,J=2.4Hz,8-H),6.99(2H,dd,J=7.6,2.2Hz,3′,5′-H),7.49(2H,dd,J=7.6,2.2Hz,2′,6′-H)。2.35esi-ms-z柚皮素2.0g(7.20mmol),乙酸酐10mL(100mmol),濃硫酸2滴(1.87mmol)依次加入100mL附有冷凝和攪拌裝置的三口圓底燒瓶中,55℃,反應(yīng)1h(TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)。反應(yīng)畢,將反應(yīng)液傾入50mL冰鹽水中,抽濾,得白色固體,丙酮-水結(jié)晶,得白色晶體1.43g,收率71.5%。m.p.103℃。ESI-MSm/z:421[M+Na+1],397[M],353.6[M-COCH3],311[M-2COCH3];IR(KBr)/cm890.88,913.59,1618.31,1750.54,1766.56,1772.06,2924.29,3075.54,3445.39;1H-NMR(CH3COCH3-d6)δ:2.26(3H?s,?OCOCH3ˉ)?2.27(3H?s,?OCOCH2.26(3Η?s,-ΟCΟCΗ3ˉ)?2.27(3Η?s,-ΟCΟCΗ3ˉ)?2.28(3H?s,?OCOC3ˉ)?2.28(3Η?s,-ΟCΟCH3ˉˉˉˉ)?2.80(1HΗ3ˉ)?2.80(1Η,dd,J=16.8Hz,J=12.6Hz,3-H),3.30(1H,dd,J=16.8Hz,J=3.0Hz,3-H),5.68(1H,dd,J=12.6Hz,J=3.0Hz,2-H),6.60(1H,d,J=2.2Hz,6-H),6.82(1H,d,J=2.2Hz,8-H),7.21(2H,d,J=7.4,2.0Hz,3′,5′-H),7.64(2H,d,J=7.4,2.0Hz,2′,6′-H)。3腫瘤活性篩選3.1mtt法檢測(cè)細(xì)胞抑制率取處于指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的SMMC-CTT21人源肝腫瘤細(xì)胞一瓶,加入體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化液,消化至貼壁細(xì)胞脫落,計(jì)數(shù)(5~8)×104個(gè)/mL,制成懸浮液。取細(xì)胞懸液接種于96孔板上,100μL/孔,置恒溫CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h。加入受試藥物(30μmol/L),100μL/孔,培養(yǎng)48h。吸取上清液,加入MTT(0.5mg/mL),200μL/孔,培養(yǎng)4h。吸取上清液,加入DMSO,120μL/孔,加畢,于570nm處用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔的吸光值,并計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率%=(陰性對(duì)照組OD值-藥敏組OD值)∕陰性對(duì)照組OD值3.2結(jié)果7,4′-二甲基柚皮素體外細(xì)胞抑制率為7.60%,7,4′-三乙酰柚皮素體外細(xì)胞抑制率為4.10%。4討論4.1碘甲烷的合成黃酮類化合物烷基化包括甲基化、乙基化、丙基化、芐基化等。目前研究較多的主要集中在甲基化方面,通常采用碘甲烷和硫酸二甲酯作為甲基化試劑。和硫酸二甲酯相比,碘甲烷毒性小,腐蝕性低,活性好,反應(yīng)時(shí)間短,產(chǎn)率高,后處理比較簡(jiǎn)單。黃酮類化合物的?；幸阴；?、磺酰化、芐化等,而乙?；浅Ｓ玫姆椒āＲ阴；Ｒ砸宜狒?、乙酰氯、冰醋酸為?；噭?濃硫酸、吡啶、AlCl3、ZnCl2等為催化劑。由于冰醋酸活性低,反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng),乙酰氯活性高,從而使反應(yīng)不易控制,而乙酸酐活性適中,反應(yīng)易于控制,故較為常用。AlCl3和ZnCl2對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重,吡啶在產(chǎn)物中的殘留難以徹底去除,所以常選用濃硫酸為催化劑。4.2甲基柚皮素柚皮素由于5-OH的空間位阻較大,且易與4位羰基締合形成分子內(nèi)氫鍵而成為穩(wěn)定的六元環(huán),故其反應(yīng)活性較低,難與K2CO3成鹽,不能進(jìn)一步發(fā)生