中藥有效成分的幾個(gè)問題

到目前為止，人們對(duì)中藥的療效仍有很大不同，因此我們使用的研究方法也不同。這導(dǎo)致了不同的相互控制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥物的治療效果。目前,我國中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與發(fā)達(dá)國家的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有較大差距,致使我國的中成藥很難進(jìn)入發(fā)達(dá)國家的藥品主流市場(chǎng)。為早日改變我國中成藥在國際藥品市場(chǎng)上的不利地位,我國中藥研究工作者必須對(duì)中藥的有效成分有一個(gè)科學(xué)的認(rèn)識(shí),然后確立一種科學(xué)的研究、分析和制備中藥有效成分的方法,使我國中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合發(fā)達(dá)國家的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本著百家爭(zhēng)鳴和百花齊放的精神,就有關(guān)中藥有效成分的概念、來源及分析有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性等幾個(gè)重要問題與同道們商榷,以期求得共識(shí)和達(dá)到加速中藥現(xiàn)代化的目的。1關(guān)于“全成分論”和“多成分論”的觀點(diǎn)的描述,主要有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分有效成分至今,關(guān)于什么是中藥有效成分的認(rèn)識(shí)很不一致。有人提出中藥介于藥物和食品之間的論點(diǎn),認(rèn)為中藥材中所有化學(xué)成分都是有效成分(簡(jiǎn)稱全成分論)。當(dāng)然我們的認(rèn)識(shí)與這種觀點(diǎn)差異較大,否則就不會(huì)探討和分析中藥有效成分的問題了。近10年來,在報(bào)章雜志和學(xué)術(shù)會(huì)議上經(jīng)常有人提出中藥復(fù)方的作用為多成分和多靶點(diǎn)綜合效應(yīng)的觀點(diǎn)(簡(jiǎn)稱多成分論)。提出這種論點(diǎn)的學(xué)者們的論據(jù)很簡(jiǎn)單,他們說因?yàn)橹兴帍?fù)方由多味中藥組成,如果一味中藥含十幾種乃至幾十種成分,那么一個(gè)復(fù)方就可能含幾十種乃至上百種成分,所以一個(gè)中藥復(fù)方的作用是幾十種乃至上百種成分的綜合效應(yīng)。這樣看來研究中藥復(fù)方的有效成分談何容易,這也是至今人們對(duì)中藥復(fù)方有效成分研究望而卻步的主要原因。其實(shí)“全成分論”和“多成分論”的認(rèn)識(shí)本質(zhì)是相同的,即他們都把中藥材中的化學(xué)成分看成為有效成分。對(duì)上述‘全成分論’和‘多成分論’的觀點(diǎn),我們持謹(jǐn)慎和保留態(tài)度。這是因?yàn)?唯物辯證法認(rèn)為,如果是存在著兩個(gè)以上矛盾的復(fù)雜過程的話,就要用全力找出它的主要矛盾,捉住了這個(gè)主要矛盾,一切問題就迎刃而解了。疾病和治療疾病的藥物是矛盾是對(duì)立統(tǒng)一體的兩個(gè)方面,例如治療高血壓癥的中藥復(fù)方,因?yàn)檠獕荷呤窃撨^程的主要矛盾,所以中藥復(fù)方中降血壓成分應(yīng)視為解決主要矛盾的主要有效成分;而其它,如鎮(zhèn)靜和利尿等有助于高血壓治療和康復(fù)的成分應(yīng)視為解決主要矛盾的次要有效成分。所以解決這一問題的關(guān)鍵在于能否找到該復(fù)方降血壓以及鎮(zhèn)靜、利尿有效成分。我們認(rèn)為任何一個(gè)較好的和符合中醫(yī)組方原則的中藥復(fù)方中,君藥經(jīng)常為一種,其中主要有效成分不會(huì)很多,可能只有一種或幾種化合物。而臣藥或佐使藥中的次要有效成分可能幾種或更多些,諸種次要成分對(duì)主要有效成分的藥理作用起到作用協(xié)同、相加、拮抗影響,最后表現(xiàn)的綜合效應(yīng),就是該復(fù)方的藥理作用。而那些具有其它生物活性的化學(xué)成分則不能視為本復(fù)方特定藥理作用的有效成分,當(dāng)然,在中成藥或水煎劑中,不能被吸收和無復(fù)方特定藥理作用的許多化學(xué)成分都不能視為有效成分。如此看來,在一個(gè)治療高血壓的中藥復(fù)方中,降壓和輔助降壓的鎮(zhèn)靜、利尿成分為該復(fù)方的有效成分,這樣的成分不會(huì)很多,幾種乃至更多些。另外,吸收入血的某些成分,經(jīng)過富集和提純后需要加大到高于其原來在血清中的濃度許多倍時(shí),才具有與本復(fù)方相關(guān)的藥理作用,這樣的化學(xué)成分也不應(yīng)視為本復(fù)方的有效成分。所以當(dāng)用高靈敏度的檢測(cè)技術(shù),如高效液相色譜儀(HPLC)和電噴霧質(zhì)譜儀(ESI—MS)確定吸收入血的化學(xué)成分時(shí),不能就認(rèn)為它們檢測(cè)出的化學(xué)成分都是有效成分,應(yīng)該說它們當(dāng)中有一部分可能是有效成分。而那些低于最小有效量或有效濃度的吸收入血化合物,依我們的觀點(diǎn)它們也不一定是該復(fù)方的有效成分。如果以上述觀點(diǎn)審視和研究中藥復(fù)方的話,我們有可能研究和開發(fā)出藥味更少和療效更高的新藥。綜上所述,我們認(rèn)為中藥復(fù)方的藥效為其主要有效成分與次要有效成分的綜合效應(yīng)。我們的觀點(diǎn)與“全成分論”和“多成分論”的區(qū)別,在于我們認(rèn)為中藥復(fù)方的有效成分不是很多,而是有限和較少的。2中藥成分代謝產(chǎn)物的研究臨床上的各種口服中成藥,其吸收入血產(chǎn)生藥效的有效成分大致有以下4個(gè)來源:①藥材固有的化學(xué)成分;②加工炮制和煎煮過程的產(chǎn)物;③腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物;④吸收入血進(jìn)入肝臟經(jīng)“首過效應(yīng)”的代謝產(chǎn)物。上述認(rèn)識(shí)已經(jīng)為大量的研究報(bào)道所證實(shí)。目前大多數(shù)從事中藥化學(xué)的研究者,對(duì)中藥有效成分的第①和②兩種來源比較熟悉,而對(duì)第③和④兩種來源知之不多,否則就不會(huì)出現(xiàn)毫無根據(jù)的將口服制劑直接改革成中藥注射劑的做法。日本學(xué)者和我們的研究已經(jīng)證明,中藥苷類成分(如甾體皂苷和黃酮苷類化合物)在口服后都要被腸內(nèi)菌代謝成新的代謝物,某些腸內(nèi)菌代謝物是其真正的有效成分,有些化合物經(jīng)門靜脈吸收進(jìn)入肝臟后,又可被肝臟代謝成新化合物?？梢?原藥材中的化合物乃是前體藥物。3中藥有效成分的主要對(duì)象要想闡明一個(gè)復(fù)方在體內(nèi)究竟是何種化學(xué)成分起到治療作用及其作用機(jī)制,并非簡(jiǎn)單和容易解決的事情。以前人們稱其為理不出頭緒的一團(tuán)亂麻,或稱其為難以琢磨的“黑匣子”。如何打開這個(gè)“黑匣子”乃是我們藥學(xué)工作者為之奮斗多年和夢(mèng)寐以求的事情。因?yàn)槿绻芷谱g這個(gè)“黑匣子”,我們將從中獲得許多寶貴的信息,如可能開發(fā)出中藥復(fù)方一類新藥、可能發(fā)現(xiàn)許多有活性的先導(dǎo)化合物、可能從分子水平揭示復(fù)方的作用機(jī)制和各有效成分的相互配伍關(guān)系等等?，F(xiàn)在首要問題是先要確定“黑匣子”的位置和打開它的途徑。我們認(rèn)為中藥活性成分的“黑匣子”在血清中。因?yàn)橹挥醒迨巧鲜?種來源的活性成分共存的唯一位置。無論是藥材中的固有成分、煎煮過程產(chǎn)生的成分或經(jīng)腸內(nèi)菌和肝臟代謝產(chǎn)生的成分,絕大部分有效成分(除了治療胃腸道內(nèi)疾病,如腸炎和胃潰瘍外)都要在吸收入血后才能產(chǎn)生治療作用。因此應(yīng)該把服藥動(dòng)物或人的血清做為研究和分析中藥有效成分主要對(duì)象。在國家自然科學(xué)基金會(huì)和國家中醫(yī)藥管理局的資助下,我們相繼研究了大鼠和人口服單體化合物人參皂苷Rb1、Rg1、淫羊藿苷、氧化苦參堿及有效部分黃山藥總苷和人參二醇組皂苷以及中藥復(fù)方(芍藥甘草湯和參附湯)腸內(nèi)菌代謝物和吸收入血成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性。不難看出我們的上述研究工作是由簡(jiǎn)單到復(fù)雜,除芍藥甘草湯和參附湯的研究仍在進(jìn)行外,其它研究已陸續(xù)完成?？偟目磥?在我們確立的前述中藥有效成分概念的前提下,對(duì)HPLC和ESI-MS檢測(cè)的吸收入血化學(xué)成分進(jìn)行活性分析,結(jié)果表明,真正的有效成分是有限的和少數(shù)的?？梢?由于將血清作為分析中藥有效成分的切入點(diǎn),就把本來十分復(fù)雜的問題大大地簡(jiǎn)單化了。實(shí)踐證明,我們提出“中藥復(fù)方的藥效為其主要有效成分和次要有效成分的綜合效應(yīng)”的觀點(diǎn)比較符合實(shí)際。而“兩多論”只能使許多人對(duì)中藥研究陷于茫然不知所措的境地。4確定血液中生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)的確定方法4.1復(fù)配后樣品的富集和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般選用大鼠,一組大鼠灌胃所試藥物,另一組灌胃相同體積生理鹽水。給藥后,將大鼠置于不銹鋼制的代謝籠中收集大量尿液,從而富集了某些吸收入血的代謝物。收取足夠的尿液后,于給藥后適當(dāng)時(shí)間(估計(jì)血藥濃度最高的時(shí)間)將大鼠剪頭處死,接取血液,制備血清。將上述尿液和血清用適當(dāng)?shù)娜苊捷腿?回收溶媒后得到提取部分。以薄板層析(TLC)、高效液相層析(HPLC)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)等平行檢查對(duì)照組和給藥組尿液及血清提取物在譜圖上的差異。要根據(jù)已經(jīng)掌握的復(fù)方中各種中藥的已知化學(xué)成分,選擇幾種溶媒處理血和尿液樣品。在用HPLC檢測(cè)樣品時(shí),為了防止漏檢,不能只用一種檢測(cè)器,最好用紫外檢測(cè)器(UVD)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)或電化學(xué)檢測(cè)器(EC)等幾種檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),這樣才能保證把樣品中有和無紫外吸收的化合物都能檢測(cè)出來。實(shí)踐證明,一般情況下,藥物腸內(nèi)菌代謝物可用TLC檢測(cè),尿樣品經(jīng)富集后,許多代謝物在HPLC譜圖上顯示明顯,由于吸收入血成分在血清樣品的濃度甚低,故往往在尿液樣品中檢出的成分,而在血清中卻難于檢測(cè)到。因此,我們非常重視尿液的富集和檢測(cè)。至于是否有些化合物僅在血和膽汁中存在,而其在尿液中卻不存在的情況,尚難斷言。為防止這種情況出現(xiàn),我們認(rèn)為也應(yīng)收集動(dòng)物的膽汁進(jìn)行檢測(cè)。我們也經(jīng)常采集服藥人的血清和尿液進(jìn)行分析,確定吸收入血藥物成分。實(shí)踐證明,綜合應(yīng)用TLC,HPLC或ESI-MS對(duì)服藥動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的尿液、血清和膽汁進(jìn)行細(xì)致的對(duì)比檢測(cè)分析,可基本上確定吸收入血成分。4.2rh1對(duì)thp-1細(xì)胞毒性的影響用上述方法確定吸收入血成分后,對(duì)于可大量獲得的樣品,可用整體藥理學(xué)方法確定其活性,對(duì)于暫時(shí)尚不能大量獲得的樣品,可用離體藥理學(xué)方法或檢測(cè)與整體藥理有關(guān)的細(xì)胞因子分泌或作用的方法確定其活性。如當(dāng)我們用腸內(nèi)菌代謝研究證明,人和大鼠灌服人參皂苷Rg1后,盡管其在腸道內(nèi)被代謝成為幾種代謝物,但只有代謝物Rh1被明顯吸收入血。由于目前尚難于大量獲得Rh1,于是,我們首先觀察Rh1對(duì)THP-1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響,發(fā)現(xiàn)Rh1可促進(jìn)THP-1細(xì)胞分泌TNFα及其mRNA的基因表達(dá)。進(jìn)一步研究證明Rh1對(duì)離體腫瘤細(xì)胞有抑制作用,最后在整體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)Rh1對(duì)幾種移植性腫瘤有抑制作用。復(fù)方有效成分的檢測(cè)方法和程序更為復(fù)雜一些,如給大鼠灌服芍藥甘草湯后,對(duì)每個(gè)吸收入血的代謝物,不但要檢測(cè)其鎮(zhèn)痛作用,而且還要檢測(cè)其鎮(zhèn)靜和解痙作用,甚至還要觀察各成分之間的配伍協(xié)同作用。實(shí)踐證明,在吸收入血的代謝物中,只有少數(shù)化學(xué)成分具有特定藥理作用。4.3質(zhì)譜條件的確定如果灌胃給予的化合物為已知結(jié)構(gòu)的苷類化合物,經(jīng)檢測(cè)其吸收入血的某一成分為活性成分,那么用ESI-MS就可直接確定其吸收入血成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因?yàn)橛肊SI-MS,可直接捕捉檢測(cè)樣品中與已知結(jié)構(gòu)苷類化合物及其代謝產(chǎn)物分子量相對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)分子離子峰,然后再對(duì)各離子峰進(jìn)行二級(jí)(直至三級(jí)、四級(jí))質(zhì)譜分析,根據(jù)次級(jí)碎片的脫糖規(guī)律基本上可以確定入血成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。對(duì)于出現(xiàn)于血及尿液中的有效成分為非苷類未知化合物,則不能用ESI-MS直接確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),只能從尿液中將其富集或用腸內(nèi)菌代謝的方法將其制備提純后,按常規(guī)方法做光譜學(xué)分析后,才能確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。5血清和歷史代碼的制備用TLC,HPLC或ESI-MS等檢測(cè)方法,通過對(duì)比分析對(duì)照組和給藥組血清或尿液樣品的譜圖,可以確定吸收入血代謝物的存在。但如何制備和獲得一定量的代謝物,供給光譜學(xué)分析和生物檢測(cè)。就目前的制備技術(shù)來看,尚有一定難度。我們實(shí)驗(yàn)室采取下述方法獲得代謝物。5.1般營養(yǎng)化合物類物當(dāng)用TLC和HPLC對(duì)比分析血清、尿液和腸內(nèi)菌代謝物,并證明在血清或尿液中均存在同腸內(nèi)菌代謝物相同的成分時(shí),即表明該代謝物是其前體化合物經(jīng)腸內(nèi)菌代謝后的產(chǎn)物。于是,我們可用離體腸內(nèi)菌代謝其前體化合物的方法制備該代謝物,并用常規(guī)植物化學(xué)分離方法從腸內(nèi)菌代謝物中將其制備和精制出來。在我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常采用這種方法制備代謝物。如果研究對(duì)象是中藥復(fù)方,我們必須用灌服單味藥的方法首先確定吸收入血代謝物是來自何種單味中藥及屬何類化合物。然后從該單味藥中提取該化合物,進(jìn)一步進(jìn)行離體腸內(nèi)菌代謝和得到吸收入血代謝物。5.2藥物的應(yīng)用如果綜合分析表明,某種入血代謝物不是腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物,其在血清中濃度很低,血清量又非常少,所以從血清中制備出一定量的代謝物以供光譜學(xué)分析及生物活性檢測(cè)幾乎是不可能的。因此我們采用給大鼠或人多次服用藥物,然后收集大量尿液,從中富集和提取代謝物供光譜學(xué)分析和生物活性檢測(cè)。實(shí)踐證明,通過尿液富集代謝物的方法也是可行的。6中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在我國藥分經(jīng)過上述對(duì)灌服中藥動(dòng)物和人的血清、尿液及腸內(nèi)菌代謝物樣品的交叉印證分析,可確定吸收入血代謝物;再用整體和離體藥理學(xué)方法、細(xì)胞因子及基因表達(dá)方法確定吸收入血代謝物的活性;然后可用各種適宜的方法(化學(xué)合成、水解、酶解及細(xì)菌代謝等)制備吸收入血的有效成分;最后可參考各種吸收入血有效成分的血藥濃度,將各有效成分配制成新的中藥復(fù)方制劑,該復(fù)方制劑無論口服或注射都應(yīng)該具有與口服原中藥制劑相同的藥理作用。由于該復(fù)方中只存在有效成分,更由于是用有效成分配制而成,所以制劑中每個(gè)成分的含量都會(huì)像西藥復(fù)方制劑那樣精確。這樣的中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),完全可以同世界各發(fā)達(dá)國家的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)接軌。近五年來,我們按上述思路和研究方法進(jìn)行中藥活性成分的研究,經(jīng)歷了從單個(gè)化